NSUN6介导的高化学计量m5C修饰在乳腺癌转移中的机制研究及治疗应用

本研究揭示了tRNA修饰酶NSUN6通过识别mRNA特定茎环结构（含C*UCCA基序）独立催化高化学计量m5C修饰的分子机制。研究人员发现NSUN6通过差异化识别tRNA与mRNA底物的策略，促进乳腺癌细胞迁移依赖其mRNA修饰活性，并鉴定YBX1/YBX3为m5C阅读器。该发现为乳腺癌治疗和mRNA疫苗设计提供了新思路。

　　

在RNA表观遗传学领域，mRNA修饰正成为调控基因表达的新维度。尽管N6-甲基腺苷(m⁶A)研究已较为深入，但其他修饰如5-甲基胞苷(m⁵C)的催化机制和功能仍存在诸多谜团。特别值得注意的是，绝大多数非m⁶A修饰缺乏专属的催化机器，通常由tRNA修饰酶兼职完成，这种"一酶多底物"现象引发了关于修饰特异性和功能解析的挑战。更复杂的是，现有研究难以区分tRNA修饰对翻译过程的间接影响与mRNA修饰的直接作用，使得m⁵C的功能研究陷入争议。

上海科技大学等机构的研究团队在《Nature Communications》发表的研究，系统阐明了NSUN6介导的高化学计量m⁵C修饰在乳腺癌转移中的分子机制。研究人员通过创新性的实验设计，成功分离了NSUN6对tRNA和mRNA的催化活性，发现其通过差异化识别策略（对tRNA需要L型三级结构，对mRNA仅需茎环结构）实现底物选择性。研究不仅揭示了m⁵C修饰促进mRNA稳定的新机制，还开发了基于该原理增强治疗性mRNA稳定性的新策略。

关键技术方法包括：1）体外甲基转移酶活性测定结合RNA质谱验证m⁵C修饰；2）SHAPE技术解析RNA二级结构特征；3）超快亚硫酸氢盐测序(UBS-seq)全转录组检测m⁵C位点；4）AlphaFold3预测蛋白质-RNA互作结构；5）乳腺癌细胞迁移模型（使用MDA-MB-231等三阴性乳腺癌细胞系）。

【NSUN6高效催化mRNA的m⁵C修饰】研究发现NSUN6对特定mRNA底物（如FURIN、MAPK3）的催化效率甚至高于其经典tRNA底物tRNA^Thr(UGU)。动力学参数显示，对FURIN的k_cat/K_m值(0.36 min^-1μM^-1)是对tRNA的2倍。质谱分析确认了修饰产物确为m⁵C。

5C修饰的效率验证'>

【mRNA底物的结构特征】SHAPE技术揭示高m⁵C水平的mRNA底物具有共性特征：包含CUCCA基序的10-12nt环区，茎部前两对碱基偏好非G-C配对。25nt的茎环核心即可支持高效甲基化，而将CUCCA移至茎区则完全丧失修饰活性。

【差异化识别机制】结构生物学分析发现，NSUN6通过相同催化口袋识别tRNA和mRNA的C*UCYA基序，但采用不同RNA结合表面：K159A/R181A突变使tRNA催化活性完全丧失而保留mRNA活性，证明PUA域正电斑块1仅参与tRNA识别。AlphaFold3预测模型显示mRNA茎环主要与MTase域正电斑块2相互作用。

【促迁移功能验证】NSUN6敲除使MDA-MB-231细胞迁移能力下降60%，而仅恢复mRNA催化活性的K159A/R181A突变体即可完全挽救表型。UBS-seq鉴定到205个NSUN6依赖性m⁵C位点，其中18个位点修饰水平>50%，且73%位于编码区。

【m⁵C阅读器机制】RNA pull-down联合质谱鉴定YBX1/YBX3为特异性阅读器。BLI测定显示YBX3 CSD对m⁵C RNA结合力(KD=45.0nM)显著高于未修饰RNA。结构预测揭示W97残基与m⁵C形成π-π堆叠，W97F突变体丧失稳定mRNA能力。

【治疗应用】在mRNA-1273疫苗3'UTR引入NSUN6靶序列（FURIN-25nt），使报告基因表达提高3倍且半衰期延长2小时，而催化位点突变则无此效应。

这项研究首次阐明NSUN6通过结构特异性识别机制在mRNA上建立高化学计量m⁵C修饰，突破了"tRNA修饰酶难以高效催化mRNA"的传统认知。发现迁移相关mRNA集群的协同调控模式，为肿瘤转移提供了新的诊断标志物。开发的单点高m⁵C修饰策略，为mRNA药物设计提供了创新思路。值得注意的是，该研究建立的"酶活性分离"策略为解析多底物修饰酶的功能提供了范式，YBX家族蛋白的层级识别机制（YBX3高亲和力但低表达）也展现了RNA修饰调控的精细平衡。这些发现不仅推进了对RNA表观遗传学的理解，也为肿瘤治疗和RNA药物研发开辟了新途径。