基于基因工程仿生纳米囊泡的配体-受体介导和酶控膜融合高效siRNA递送系统研究

本研究针对肿瘤治疗中siRNA递送效率低的关键难题，创新性地开发了具有肿瘤识别和酶控膜融合功能的仿生纳米囊泡(siRNA@eS-BNVs)。研究人员通过基因编辑技术构建了表达突变刺突蛋白(S蛋白)的HEK293TACE2-细胞膜，制备的纳米囊泡能特异性识别表达ACE2受体的肿瘤细胞，并在凝血酶(Thr)触发下实现膜融合，显著提高了siRNA的胞质递送效率。动物实验证实该系统能有效沉默EGFR基因，抑制肿瘤生长和肺转移，为精准药物递送提供了新策略。

　　

在肿瘤基因治疗领域，小干扰RNA(siRNA)技术因其能特异性沉默致癌基因而备受关注。然而，裸露的siRNA面临多重递送障碍：易被核酸酶降解、难以富集在肿瘤组织、细胞摄取效率低、内体逃逸困难等。传统递送系统如阳离子聚合物纳米粒、脂质纳米粒(LNPs)和细胞膜包被纳米粒(CNPs)虽取得进展，但胞质递送效率仍不理想。特别是大部分siRNA会在溶酶体中被降解，严重影响RNA干扰(RNAi)效果。如何突破这些屏障，实现高效、精准的siRNA递送成为领域内亟待解决的关键科学问题。

针对这一挑战，研究人员开展了基于刺突蛋白(S蛋白)膜融合机制的仿生纳米囊泡研究。通过基因工程技术构建了血管紧张素转换酶2(ACE2)受体敲除且表达突变S蛋白的HEK293T^ACE2-细胞(eS-HEK293T^ACE2-)，并利用其细胞膜制备了仿生纳米囊泡(eS-BNVs)。该系统创新性地将肿瘤靶向识别与酶控膜融合功能整合于单一平台，通过配体-受体相互作用和凝血酶(Thr)触发的膜融合机制，实现了siRNA的高效胞质递送。相关研究成果发表在《Nature Communications》上。

研究主要采用以下关键技术：1)基因编辑构建ACE2敲除和S蛋白突变的HEK293T细胞系；2)细胞膜提取和纳米囊泡制备技术；3)单分子荧光技术定量囊泡内siRNA装载量；4)体外膜融合实验体系(包括内容混合实验和TEM动态观察)；5)活体成像和分子生物学方法评估基因沉默效果；6)皮下移植瘤和肺转移瘤模型验证治疗效果。实验所用A549^ACE2+肺癌细胞系和BALB/c裸鼠均来自标准保藏机构。

遗传工程构建S蛋白过表达的仿生纳米囊泡

研究人员首先通过shRNA敲除HEK293T细胞的ACE2受体，并将S蛋白的天然S2'切割位点(KPSKR)突变为Thr酶切位点(LVPRGS)，构建了eS-HEK293T^ACE2-细胞。Western blot和流式细胞术证实了S蛋白的高表达。通过超声和机械挤压法制备的eS-BNVs平均流体力学直径为116 nm，透射电镜显示其具有典型的囊泡形态。SDS-PAGE和Western blot验证了S蛋白在纳米囊泡表面的成功锚定。

eS-BNVs与癌细胞的识别和结合

免疫荧光证实A549^ACE2+癌细胞高表达ACE2受体。将DiI标记的eS-BNVs^DiI与癌细胞共孵育后，共聚焦显微镜观察到eS-BNVs^DiI能高效结合A549^ACE2+细胞膜，流式细胞术定量显示其结合效率显著高于对照No-BNVs^DiI。Western blot分析进一步证实了eS-BNVs与A549^ACE2+细胞的特异性结合，而与ACE2敲除的A549^ACE2-细胞结合较弱。

体外酶控膜融合研究

内容混合实验显示，Thr酶能特异性触发SRB@eS-BNVs与NV^ACE2+的膜融合，荧光强度增加约2.87倍。Western blot证实Thr酶能切割突变S蛋白(180 kDa条带消失)，而对野生型刺突蛋白(S^WT)无影响。透射电镜动态捕捉了eS-BNVs与金标记A549^ACE2+-BNVs的膜融合全过程，包括靶向识别、融合孔形成和完全融合等关键步骤。

eS-BNVs介导的siRNA胞内递送

通过单分子荧光技术测定，单个siRNA@eS-BNVs平均装载2-5个siRNA分子。共聚焦显微镜观察显示，siRNA-Cy5@eS-BNVs+Thr组的癌细胞摄取效率是对照组的2.87倍，且溶酶体共定位率从57.55%降至21.39%，表明主要通过膜融合途径递送。流式细胞术进一步验证了Thr酶能显著提升siRNA-Cy5的胞内递送效率。

体外和体内基因沉默效果

在A549^ACE2+-Luc细胞中，siLuc@eS-BNVs+Thr使荧光素酶活性降低至PBS组的21.67%，mRNA水平下降最显著。在荷瘤小鼠模型中，静脉注射siLuc@eS-BNVs+Thr使肿瘤生物发光强度在48小时降至27.30%，显著优于其他组别。RT-qPCR证实肿瘤组织内Luc mRNA表达被有效抑制。

体内药代动力学和分布

活体成像显示siRNA-Cy5@eS-BNVs+Thr在肿瘤中的蓄积量最高，是其他器官的3-5倍。免疫荧光显示其能从血管外渗并均匀分布至肿瘤深部(约200 μm)。药代动力学研究表明siRNA@eS-BNVs能显著延长siRNA的血浆半衰期。

siEGFR@eS-BNVs的抗肿瘤效果

在A549^ACE2+皮下瘤模型中，siEGFR@eS-BNVs+Thr使肿瘤体积最小，生存期最长。Western blot和免疫荧光显示肿瘤组织EGFR表达显著下调。在肺转移模型中，该治疗使转移灶生物发光强度降低最显著，H&E染色显示肺转移灶数量最少，生存率提高。

这项研究开创性地将病毒膜融合机制应用于药物递送领域，通过基因工程改造的仿生纳米囊泡，实现了配体-受体介导的靶向识别和酶控膜融合的协同作用。与常规递送系统相比，eS-BNVs展现出三大优势：1)通过S蛋白-ACE2相互作用实现肿瘤特异性靶向；2)Thr酶触发膜融合绕过内体-溶酶体途径，提高胞质递送效率；3)模块化设计可灵活装载不同核酸药物。研究不仅为EGFR阳性肿瘤治疗提供了新方案，更建立了可推广的精准递送平台技术，对RNAi疗法和其他生物大分子药物的临床应用具有重要启示意义。