评估流式细胞术替代方法在犀牛精子性别分选中的应用：TLR激活与磁性纳米颗粒技术的探索

为解决犀牛迁地保护种群性别比例管理难题，研究人员评估了Toll样受体(TLR)激活和磁性纳米颗粒(MACS)两种替代流式细胞术(FACS)的性别分选技术。结果表明，TLR7/8在犀牛精子中特异性表达，但TLR8配体仅降低精子运动速度(VAP)，未能实现X/Y精子分离；MACS技术虽能结合部分精子，但未观察到X精子富集现象。该研究为优化濒危物种辅助生殖技术提供了重要基础数据。

　　

犀牛作为濒危物种，其迁地保护面临严峻的性别比例失衡问题。成年雄性黑犀牛需要单独饲养，雄性过多会导致设施压力剧增；而白犀牛和印度犀牛种群则长期呈现雌性偏多趋势。人工授精结合性别分选精子技术可有效调控后代性别比例，但现行荧光激活细胞分选技术(FACS)存在设备昂贵(>10万美元)、处理时间长、冷冻精子兼容性差等缺陷。为此，美国辛辛那提动物园等机构的研究团队在《Theriogenology Wild》发表论文，探索Toll样受体(TLR)激活和磁性纳米颗粒(MACS)两种替代方案。

研究采用免疫荧光染色、实时定量PCR、zeta电位分析等技术，对5头白犀牛和5头印度犀牛的13份精液样本(5份新鲜、8份冷冻)进行分析。通过TLR7/8抗体定位、TLR8配体(motolimod)处理及磁性纳米粒子孵育实验，评估两种方法对X/Y精子分离的效果。

3.1. Toll样受体激活
免疫荧光证实TLR7主要定位于精子头部(90-95%)，TLR8则分布于鞭毛区域(~50%)。30μM TLR8配体使精子平均路径速度(VAP)从27.22降至18.44μm/s，但上下层精子性别比仍维持50:50。与小鼠、牛等物种不同，犀牛精子未表现出TLR介导的X精子运动抑制效应，可能与配体特异性或葡萄糖代谢差异有关。

3.2. 磁性纳米颗粒
犀牛精子在六种缓冲液中zeta电位为-26.7至-10.6mV，但未出现人类精子典型的双峰分布。50nm磁性纳米颗粒在mEQ缓冲液中保持-25.2mV表面电荷，能结合20-65%精子，但未实现X精子富集(X:Y比0.978-1.016)。这与马属动物研究中90%的分离效率形成对比，可能反映物种特异性电荷分布差异。

研究表明，现有TLR激活和MACS方案虽不能直接分离犀牛X/Y精子，但揭示了物种特异性生理特征：TLR8配体可调控运动性而不影响性别比，磁性纳米颗粒结合率与缓冲液导电性密切相关。这些发现为优化濒危物种辅助生殖技术提供了关键参数，提示需开发物种特异性的配体或表面电荷筛选策略。研究强调，保护生物学需兼顾技术创新与物种基础生物学研究，为破解犀牛保护中的"性别难题"开辟了新思路。