非洲草原象支气管肺泡灌洗液中单核细胞分离与细胞学评估的优化方案及其在结核病研究中的应用

针对非洲象呼吸道免疫细胞研究的技术空白，研究人员通过优化支气管肺泡灌洗液(BAL)处理流程，结合粘蛋白消化、Ficoll梯度分离等步骤，首次成功分离出高活性肺泡巨噬细胞(AMs)（占比92.5-100%），为象科动物呼吸道疾病（如结核病TB）的局部免疫应答研究奠定方法学基础。

　　

非洲草原象（Loxodonta africana）作为濒危物种，面临栖息地丧失和传染病威胁，其中结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis complex）感染导致的呼吸道疾病尤为突出。然而，由于体型庞大和技术限制，象科动物呼吸道免疫研究长期滞后。传统血液样本无法准确反映肺部免疫状态，而支气管肺泡灌洗（BAL）技术虽能获取呼吸道局部细胞，却因样本含大量粘液和环境污染物导致细胞回收率低下。这一技术瓶颈严重阻碍了对象科动物呼吸道疾病（如结核病TB）的免疫机制研究。

为突破这一困境，来自南非克鲁格国家公园的跨学科团队在《Veterinary Immunology and Immunopathology》发表研究，首次建立针对非洲象BAL样本的标准化细胞分离流程。研究人员通过整合粘蛋白消化（1,4-二硫苏糖醇DTT处理）、100 μm过滤、Ficoll密度梯度离心等关键步骤，成功从10头野生成年公象的BAL样本中分离出高纯度肺泡巨噬细胞（AMs），细胞活性超过90%。

主要技术方法
研究团队在野外条件下对麻醉后的象群实施支气管镜引导的BAL采样，每次灌注350-500 mL生理盐水，回收100-150 mL灌洗液。样本经离心浓缩后，采用DTT消化粘蛋白，过滤去除大型颗粒，再通过Ficoll-Paque PLUS密度梯度分离富集单核细胞，最后通过Rapi-Diff染色和全玻片扫描进行细胞分类计数。

研究结果
3.1 优化方案显著提升细胞得率
对比传统方法，新流程使细胞回收量达2.73-9.75×10⁶，镜下观察显示污染物显著减少。粘蛋白消化和Ficoll梯度分离被证实为提升单核细胞回收质量的关键步骤。

3.2 肺泡巨噬细胞占绝对优势
健康象群BAL中AMs占比达92.5-100%，淋巴细胞（0-6%）、中性粒细胞（0-3%）和嗜酸性粒细胞（0-1%）占比极低。其中23/038号个体所有检测细胞均为AMs，而23/1471号个体淋巴细胞比例最高（6%）。

3.3 细胞形态特征解析
AMs多呈圆形或卵圆形，部分含双核或多核结构，常见吞噬颗粒（如花粉）现象。淋巴细胞体积较小，胞质环状；中性粒细胞具分叶核，胞质颗粒浅淡。特殊发现包括23/1488号个体的含铁血黄素巨噬细胞。

研究意义
该研究建立的标准化流程解决了大型野生动物呼吸道样本处理的技术难题：

1. 首创的DTT消化步骤有效破解象科动物呼吸道粘液屏障，细胞回收效率提升10倍以上；
2. Ficoll梯度分离在保留单核细胞的同时去除90%环境污染物，适用于野外实验室条件；
3. 首次揭示健康非洲象BAL细胞组成特征，AMs的绝对优势提示其在呼吸道免疫中的核心地位。

这项成果为后续研究象科动物呼吸道疾病（如TB）的免疫机制提供了关键技术支撑，尤其对开发新型结核病诊断方法具有重要价值。研究者特别指出，未来需扩大样本量涵盖不同年龄、性别个体，并建议在诊断性研究中省略Ficoll步骤以保留粒细胞信息。该方案还可推广至其他大型野生动物呼吸道研究领域。