连接酶诱导的DNA自组装新策略：从瞬态配对到稳定纳米结构的构建

本文针对传统DNA自组装中短链粘性末端（5-nt以下）结合不稳定的问题，提出了一种连接酶诱导的主动组装策略。研究通过T4 DNA连接酶将瞬态碱基配对转化为永久共价连接，成功构建了离散型四臂连接体（4-arm junction）二维晶格（2×2至6×6）、一维延伸结构及多级组装体（如雪片状DNA折纸单元）。该方法突破了常规杂交组装的温度限制（可在4°C实现），显著提升了短粘性末端（3-nt至5-nt）的组装效率与结构稳定性，为复杂DNA纳米结构的精准构建提供了新范式。

　　

论文解读

研究背景

DNA纳米技术凭借沃森-克里克碱基配对规则，已实现从简单双链到复杂折纸结构的精准构建。然而，传统组装依赖长链粘性末端（通常>8 nt）的稳定杂交，短链粘性末端（≤5 nt）因结合力弱难以维持结构稳定性，严重限制了纳米结构的微型化与动态调控能力。现有技术中，DNA连接酶（ligase）多用于组装后稳定化处理，其主动参与组装过程的潜力尚未充分开发。如何利用酶促反应将瞬态结合转化为永久连接，成为突破短链组装瓶颈的关键挑战。

研究机构与方法

清华大学与华大研究院合作团队提出"连接酶诱导自组装"（ligation-induced assembly）新方法（图1）。核心策略是设计含3-nt至5-nt粘性末端的DNA元件（如四臂连接体、雪片状折纸单元），通过T4多核苷酸激酶（PNK）进行5'端磷酸化修饰，随后在T4 DNA连接酶催化下实现共价连接。关键技术包括：

1. 磷酸化处理：PNK（20 U/20μl）在含ATP缓冲液中37°C反应5小时，激活5'端磷酸基团；
2. 酶促组装：T4 DNA连接酶（400-800 U/20μl）于30°C催化16小时，优化Mg²⁺浓度（20-100 mM）及分子拥挤剂（0.5 M甜菜碱）；
3. 多级组装：预组装5×5晶格单元或折纸单元，以4-nt粘性末端二次连接构建超结构；
4. 表征手段：非变性凝胶电泳（产率计算）、原子力显微镜（AFM）、透射电镜（TEM）及热稳定性分析（40-90°C）。

研究结果

1. 离散型晶格的酶促构建

设计含5-nt粘性末端的四臂连接体单元（图2A）。无连接酶时，2×2至6×6晶格在20-35°C均无法组装（凝胶电泳无目标条带）；添加T4 DNA连接酶后，AFM清晰显示成功构建的晶格结构（图2B-D）。其中6×6晶格边长约100 nm，验证了方法的可扩展性。

2. 一维延伸结构的稳定形成

基于5个四臂连接体单元构建重复单元（图3A），单元内以10-11 bp稳定配对，单元间通过5对4-nt粘性末端连接。连接酶诱导后形成宽度一致、长度达1 μm的带状结构（图3B），显著优于无酶对照组（无目标产物）。

3. 多级超结构的高效组装

预组装的5×5晶格单元通过边界4-nt粘性末端二次连接（图4A），成功构建I型三聚体、L型三聚体、T型四聚体及X型五聚体（图4B-E）。凝胶电泳显示连接酶组的产率（>60%）显著高于传统12-nt粘性末端组装（<30%），AFM证实结构完整性。

4. 折纸单元的低温组装

雪片状DNA折纸（snowflake-shaped origami）单元（图4F）通过3-nt粘性末端连接。在4°C低温下，T4 DNA连接酶成功催化形成三角形三聚体（图4G）与菱形四聚体（图4H），TEM显示精确的几何排布，突破常规组装温度限制。

结论与意义

本研究首创的连接酶诱导自组装策略，通过将瞬态碱基配对（3-nt至5-nt）转化为共价连接，实现了三类突破：

1. 结构微型化：短链组件可构建与长链同等复杂度的结构（如含36个顶点的6×6晶格）；
2. 组装精准化：4-nt粘性末端的多级组装产率提升2倍，显著减少非特异性聚集；
3. 过程低温化：4°C实现折纸超结构构建，拓展了生物相容性应用场景。
   该策略与分子克隆（如Golden Gate组装）的核心逻辑一致，但首次应用于DNA纳米结构主动组装。未来结合多样化修饰酶（如耐热连接酶），可进一步推动动态纳米机器与活细胞内自组装系统的开发。论文发表于《Nucleic Acids Research》，为合成生物学与纳米医学提供了新工具。