HIV-1 RRE茎环II构象动态调控Rev蛋白寡聚化及核输出功能障碍的分子机制

本研究针对HIV-1病毒RNA核输出机制中Rev响应元件(RRE)的结构可塑性难题，通过解析SLII晶体结构发现其存在"紧凑型"和"延伸型"双构象态。研究人员利用结构引导突变结合Rev结合实验、分子动力学模拟和细胞功能验证，首次揭示SLII构象动态平衡通过调控Rev寡聚化影响HIV-1 RNA核输出效率，为靶向RRE构象的抗HIV药物设计提供新思路。

　　

在HIV-1病毒生命周期中，未剪接病毒RNA的核输出是病毒复制的关键环节。这一过程依赖于病毒Rev蛋白与Rev响应元件(RRE)的特异性结合，形成核糖核蛋白复合物(RNP)并通过宿主Crm1通路完成转运。然而，长达350个核苷酸的RRE结构复杂性使其分子机制长期不明，特别是作为高亲和力Rev结合位点的茎环II(SLII)结构动态如何调控Rev寡聚化，成为领域内亟待解决的科学问题。

美国马里兰大学巴尔的摩分校的Manju Ojha等研究人员在《Nucleic Acids Research》发表的研究中，首次解析了HIV-1 RRE SLII的高分辨率晶体结构，发现其存在两种截然不同的三维构象。通过整合X射线晶体学、负染色电镜、分子动力学模拟和细胞功能实验等多学科技术，研究团队揭示了SLII构象动态平衡在Rev结合与寡聚化中的调控作用，为理解HIV-1核输出机制提供了结构基础。

关键技术方法包括：1) Fab辅助RNA结晶技术解析SLII及其突变体结构；2) 负染色电镜验证溶液状态构象；3) AMBER力场分子动力学模拟分析结构动态；4) 天然聚丙烯酰胺凝胶电泳(nPAGE)检测Rev结合特性；5) HIV-1感染细胞模型评估Rev活性。

SLII晶体结构揭示独特三向连接架构
通过Fab BL3-6辅助结晶技术，研究团队成功解析了SLII结晶构建体(SLIIc)的2.42 ?分辨率结构。该结构显示SLII形成Y形拓扑，其中IIa基干茎分叉为IIb和IIc茎环，构成复杂的三向连接(3WJ)结构。值得注意的是，3WJ区域存在G34-C37四个未配对核苷酸，在晶体中形成分子间接触。

单点突变诱导构象转变
G34U单点突变导致SLII整体构象发生剧烈变化，从"紧凑型"转变为"延伸型"构象。延伸型结构中IIb茎显著延长，3WJ区碱基配对模式完全重组，G13:C32配对取代了野生型的G13·A31非经典对。这种构象转变与Rev结合能力降低相关。

结构引导突变验证构象功能关联
设计稳定紧凑构象的A31C/G39C双突变体保留了野生型的Rev结合特性，而促进延伸构象的G34C突变则显著抑制Rev寡聚化。分子动力学模拟显示紧凑构象中G34-C37核苷酸动态性低于其他未配对区，支持其作为Rev结合位点的结构基础。

细胞实验证实核输出功能障碍
在HIV-1感染细胞模型中，延伸构象稳定突变体(G34C)显著降低Gag蛋白表达和感染性病毒颗粒产量，而紧凑构象突变体(A31C/G39C)则保持正常Rev活性，证实SLII构象动态与病毒RNA核输出效率直接相关。

这项研究首次在原子水平揭示了HIV-1 RRE SLII的构象可塑性及其在Rev介导的核输出中的调控作用。提出的"构象开关"模型阐明，Rev结合会推动SLII从热力学稳定的延伸构象向功能性的紧凑构象转变，从而促进Rev寡聚化和后续的核输出复合物组装。该发现不仅解决了长期以来关于RRE结构动态调控Rev功能的争议，更重要的是为开发靶向特定RRE构象的小分子抑制剂提供了理论依据。这类构象特异性药物有望通过锁定SLII在非功能性构象来阻断HIV-1复制，为抗艾滋病药物研发开辟了新途径。