BRD9通过调控R-loop积累抑制白血病细胞生长的机制研究：转录-复制冲突的新视角

本研究针对BRD9降解剂在白血病治疗中作用机制不明的问题，通过系统研究揭示了BRD9缺失通过R-loop积累引发转录-复制冲突(TRC)导致DNA损伤的新机制。研究人员发现BRD9通过招募BRD4维持染色质稳定性，其缺失导致R-loop介导的基因组不稳定性和白血病细胞分化，为靶向BRD9-R-loop通路治疗血液肿瘤提供了理论依据。

　　

在血液系统恶性肿瘤治疗领域，靶向表观遗传调控因子的药物开发一直是研究热点。溴结构域蛋白9（BRD9）作为非经典BAF染色质重塑复合体的关键组分，近年来在急性髓系白血病（AML）、急性淋巴细胞白血病（ALL）等血液肿瘤中被发现具有重要调控作用。虽然已有研究表明PROTAC（蛋白水解靶向嵌合体）介导的BRD9降解能有效抑制白血病细胞生长，但其分子机制始终未明。更关键的是，R-loop（由新生RNA与模板DNA形成的三链结构）异常积累已被证实与基因组不稳定性密切相关，但染色质重塑因子如何调控R-loop动态平衡仍是悬而未决的科学问题。

韩国翰林大学与埃默里大学医学院的研究团队在《Nucleic Acids Research》发表的研究，首次阐明了BRD9通过维持R-loop稳态抑制转录-复制冲突（TRC）的分子机制。研究人员采用CRISPR/Cas9基因敲除、PROTAC介导的蛋白降解、MapR-seq（微球菌核酸酶-RNase H融合蛋白测序）等技术，结合DNA纤维分析、染色质免疫沉淀（ChIP）等经典方法，系统揭示了BRD9-BRD4分子轴在预防R-loop积累中的核心作用。

主要技术方法包括：1）建立BRD9敲除/敲低的白血病细胞模型；2）MapR-seq全基因组R-loop定位分析；3）DNA纤维实验检测复制叉动态；4）邻近连接实验（PLA）分析蛋白互作；5）流式细胞术评估细胞分化状态。

BRD9缺失诱导转录依赖性DNA损伤
通过中性彗星实验和γH2AX检测，研究发现BRD9缺失会导致内源性DNA双链断裂（DSB），且这种损伤依赖于转录过程。转录抑制剂triptolide处理可显著缓解BRD9缺失引起的DNA损伤，提示损伤源于转录过程异常。

BRD9缺失介导R-loop异常积累
采用S9.6抗体检测和RNase H1过表达实验证实，BRD9缺失会导致R-loop在U2OS和多种白血病细胞中显著积累。通过催化失活的RNase H（dRH）标记发现，PROTAC降解剂dBRD9处理使R-loop水平增加8-10倍，且这种积累可被RNase H1逆转。

R-loop介导复制应激抑制白血病增殖
EdU掺入实验显示BRD9缺失细胞DNA合成受阻，DNA纤维分析揭示复制叉速度降低40%。邻近连接实验（PLA）检测到RNA聚合酶II与PCNA共定位增加5倍，证实转录-复制冲突（TRC）加剧。这些变化伴随ATR-Chk1通路激活，表明R-loop积累引发了复制应激反应。

R-loop调控白血病细胞命运
流式分析显示dBRD9处理使髓系分化标志物CD11b⁺细胞增加4倍，而RNase H1过表达可逆转此效应。qPCR证实c-Myc和c-Myb表达受R-loop调控，揭示了BRD9-Rloop-Myc/Myb轴在维持白血病未分化状态中的作用。

BRD9-BRD4分子轴调控机制
免疫共沉淀和far-western blot证实BRD9通过N端直接结合BRD4。染色质分级实验显示BRD9缺失使BRD4染色质定位减少60%。DRIP-qPCR证实BRD9通过溴结构域（BD）靶向R-loop富集区域（如β-actin基因座），而N端缺失突变体丧失此功能。

全基因组分析揭示调控网络
MapR-seq发现dBRD9处理后65%的R-loop增加发生在启动子区（≤1kb TSS）。整合ChIP-seq和RNA-seq数据，证实BRD9在Myc、Myb等癌基因启动子的结合与R-loop积累呈负相关，这些基因参与RHO GTP酶循环、TP53调控等肿瘤相关通路。

这项研究首次建立了BRD9-BRD4-R-loop分子轴在白血病发生中的调控机制：BRD9通过其溴结构域定位到染色质，同时通过N端结构域招募BRD4，共同维持R-loop稳态。当这一调控网络被破坏时，R-loop异常积累会引发转录-复制冲突、复制叉停滞和DNA损伤，最终导致白血病细胞分化受阻和凋亡抵抗的解除。该发现不仅解释了PROTAC类BRD9降解剂的抗白血病机制，更为靶向R-loop的肿瘤治疗策略提供了新思路。特别值得注意的是，研究揭示的不同BAF复合体变异体（cBAF、PBAF、ncBAF）在R-loop调控中的功能保守性，暗示了染色质重塑因子维持基因组稳定的普适性机制。这些发现对理解血液肿瘤发生发展和开发新型表观遗传靶向药物具有重要指导意义。