口蹄疫病毒编码的Leader蛋白酶通过切割Dicer促进哺乳动物细胞感染的分子机制研究

本研究揭示口蹄疫病毒（FMDV）编码的Leader蛋白酶（Lpro）通过特异性切割宿主RNA干扰（RNAi）核心元件Dicer，释放其N端解旋酶结构域，从而抑制小发夹RNA（shRNA）诱导的RNAi抗病毒效应。研究人员利用基因沉默、病毒突变体感染和深度测序技术，证实Lpro对Dicer的切割是病毒免疫逃逸的关键策略，为理解哺乳动物RNAi抗病毒机制与病毒反制手段的相互作用提供了新视角。

　　

研究背景与意义
在病毒与宿主的进化博弈中，RNA干扰（RNAi）作为古老抗病毒防御机制，在植物和无脊椎动物中发挥核心作用，但其在哺乳动物中的功能长期存在争议。尽管干扰素（IFN）系统是哺乳动物抗病毒的主力军，近年研究发现RNAi通路仍可能通过Dicer介导的病毒RNA切割参与防御。口蹄疫病毒（FMDV）作为小RNA病毒科成员，其编码的Leader蛋白酶（Lpro）以多靶点切割宿主免疫蛋白著称，但能否靶向RNAi机制尚属未知。这项研究首次揭示Lpro通过切割Dicer破坏RNAi通路，为理解病毒免疫逃逸策略开辟新方向。

关键技术方法
研究团队采用以下关键技术：1）构建FMDV Lpro缺失突变体（FMDV-?Lb）及Dicer非切割突变体（Dicer-TM）；2）利用免疫印迹（Western blot）和免疫共沉淀（co-IP）验证Lpro与Dicer的相互作用；3）通过小干扰RNA（siRNA）沉默和回补实验分析Dicer抗病毒效应；4）设计EGFP-shRNA报告系统评估Lpro对RNAi的抑制；5）深度测序解析病毒小RNA（vsRNA）谱特征。实验主要在猪肾细胞（IBRS-2）和人胚肾细胞（HEK293）中进行。

研究结果

FMDV Leader蛋白酶在感染过程中切割Dicer
通过序列比对发现Dicer的Hel2结构域存在保守的KGRAR基序（图1A）。FMDV感染后，Dicer被切割产生155 kDa C端片段和63-75 kDa N端片段（图1B-D）。该过程依赖Lpro活性，突变体FMDV-?Lb无法切割Dicer（图1D）。点突变实验证实KGRAR基序是切割位点（图2D），且该过程不依赖半胱天冬酶、蛋白酶体或溶酶体途径（图2B）。

Dicer限制Lpro缺陷型FMDV突变体的复制
沉默内源性Dicer显著增强FMDV-?Lb的复制（图3D），而回补非切割型Dicer-TM可抑制野生型病毒（图3C）。这表明Dicer具有抗FMDV活性，但野生型病毒通过Lpro切割逃逸该防御。

Lpro抑制哺乳动物细胞中shRNA诱导的RNAi
Lpro表达可逆转EGFP-shRNA的基因沉默效应（图4），而催化失活突变体LbC51A无此功能。在Dicer敲除细胞（NoDice）中，截短的Dicer-?Nt（模拟Lpro切割产物）丧失RNAi功能（图6A-B），证实切割直接破坏Dicer活性。

Lpro缺失改变病毒小RNA生成谱
深度测序显示，FMDV-?Lb感染产生大量22 nt负链vsRNA，符合Dicer加工的典型siRNA特征（图7A-C）；而野生型病毒vsRNA分布杂乱且以正链为主（图7C），提示Lpro通过切割Dicer改变vsRNA加工模式。

结论与讨论
该研究首次阐明FMDV Lpro通过切割Dicer的Hel2结构域，破坏宿主RNAi抗病毒功能（图1-2）。这种机制不同于已知病毒RNAi抑制蛋白（VSR）的dsRNA结合或Dicer竞争策略，而是直接移除其功能域（图6）。vsRNA谱差异（图7）进一步佐证Lpro通过调控Dicer活性影响病毒RNA加工。

研究还揭示了RNAi与IFN通路的交叉调控：Lpro既能切割RLR信号分子（如MDA5/LGP2）抑制IFN应答，又可靶向Dicer阻断RNAi，形成“双保险”免疫逃逸策略。这种多靶点攻击模式可能解释FMDV的广宿主适应性。未来研究可探索Dicer切割片段是否作为“诱饵”干扰PKR等抗病毒蛋白（讨论提及），以及该机制在其他小RNA病毒中的保守性。

论文发表于《SCIENCE ADVANCES》，为哺乳动物RNAi抗病毒功能争议提供关键证据，并为开发靶向病毒蛋白酶的新型抗病毒药物奠定理论基础。