中胰蛋白酶自抑制构象的发现揭示丝氨酸蛋白酶选择性抑制新策略

为攻克S1家族丝氨酸蛋白酶因活性位点高度保守导致的选择性抑制难题，研究人员通过X射线晶体学首次发现中胰蛋白酶（mesotrypsin）的自抑制构象，揭示其活性位点附近的隐秘变构口袋（cryptic pocket）。基于此，团队利用高通量虚拟筛选（HTVS）鉴定出小分子抑制剂CP13，可特异性稳定中胰蛋白酶的失活状态，实现对其选择性抑制（较其他胰蛋白酶选择性提高4倍）。这一发现挑战了消化性胰蛋白酶"组成型活性"的传统认知，为开发靶向丝氨酸蛋白酶（如癌症相关蛋白酶）的高选择性变构抑制剂提供了新范式。

　　

论文解读

研究背景与意义

丝氨酸蛋白酶家族（S1 family）在人体中超过100种成员，参与凝血、免疫、消化等关键生理过程，其功能失调与癌症、炎症性疾病密切相关。然而，由于这类蛋白酶活性位点结构高度保守，开发高选择性抑制剂一直是药物研发的瓶颈。传统活性位点靶向策略常因脱靶效应导致治疗失败，尤其对中胰蛋白酶（mesotrypsin）——一种在乳腺癌、结肠癌等多种肿瘤中高表达且促进转移的蛋白酶，现有抑制剂均无法实现对其同源酶（如胰蛋白酶1/2）的选择性抑制。

研究概述

加州大学研究团队在《Science Advances》发表突破性研究，通过结构生物学和计算筛选首次揭示中胰蛋白酶存在自发形成的"自抑制构象"，并基于此开发出首个选择性变构抑制剂。该研究不仅挑战了消化性胰蛋白酶"无变构调控潜力"的传统认知，更开创了靶向隐秘变构口袋实现丝氨酸蛋白酶选择性抑制的新策略。

关键技术方法

研究采用多学科交叉技术：

1. X射线晶体学（1.6-1.7 ?分辨率）解析中胰蛋白酶无配体状态的双构象；
2. 高通量虚拟筛选（HTVS）针对隐秘口袋筛选3000万化合物库，结合分子动力学模拟评估结合稳定性；
3. 生物物理与酶学验证包括酶动力学分析、微量热泳动（MST）结合实验、位点定向突变（如W221aQ）及跨物种蛋白酶抑制谱测试。

研究结果

1. 晶体结构揭示未结合中胰蛋白酶的构象异质性

通过两种晶型获得中胰蛋白酶无配体结构（PDB: 9BOS, 9BOT）：

• 开放构象（活性态）：活性位点可及，S₁亚位点暴露，与底物结合构象一致。
• 闭合构象（自抑制态）：215-220环（自抑制环）坍缩至活性位点，遮蔽S₁口袋并暴露相邻隐秘变构口袋（图1,2）。
  能量计算显示闭合构象稳定性更高（-54 vs. -15 kcal/mol），提示其在溶液中占比更高，但酶仍可通过Gly-219顺反异构化实现构象转换。

2. 靶向隐秘口袋的高通量虚拟筛选

基于闭合构象的隐秘口袋设计筛选策略（图3）：

• 初筛3000万化合物，通过交叉对接排除开放构象结合物，保留闭合构象特异性配体。
• 分子动力学模拟验证58个候选化合物结合稳定性，最终鉴定出靶向隐秘口袋的抑制剂CP13（表S1）。

3. CP13实现中胰蛋白酶选择性抑制

• 抑制机制：CP13通过混合型抑制（mixed inhibition）结合游离酶（K_i = 47 ± 6 μM），对酶-底物复合物亲和力弱（α > 5）。
• 选择性验证：对胰蛋白酶1/2抑制弱4倍（K_i ≈ 200 μM），且对凝血因子（Xa、凝血酶）、激肽释放酶等血浆蛋白酶抑制活性极低（IC₅₀ > 溶解度限）（图4）。
• 首个性变构抑制剂：此为报道的首个选择性靶向胰蛋白酶变构位点的小分子。

4. 变构结合机制与选择性结构基础

• 关键残基：突变实验证实，中胰蛋白酶特有的Trp-221a是CP13选择性核心（W221aQ突变使K_i升高5倍），其通过π-π堆叠稳定CP13的3-羟基吡啶基团（图5）。
• 变构口袋特异性：共价抑制剂TLCK修饰活性位点后，阻断自抑制环闭合，使CP13结合信号消失（MST验证），佐证其结合依赖隐秘口袋暴露。

5. 变构抑制策略的普适性

• 序列分析：50种人源S1蛋白酶中，隐秘口袋区域（尤其221a位）序列保守性低（AMAS评分1.2 vs. 活性位点7.4）（图6）。
• 结构多样性：PDB数据库分析发现，因子IXa、类胰蛋白酶、凝血酶等多种S1蛋白酶均存在闭合构象及形态各异的隐秘口袋（图7），其静电性质与空间结构差异为选择性抑制剂设计提供可能。

结论与意义

本研究颠覆性地证明：

1. 消化性胰蛋白酶存在变构调控：中胰蛋白酶可通过自抑制环（215-220环）构象变化切换活性/非活性状态，挑战了该酶类"组成型活性"的固有认知。
2. 变构抑制剂开发新范式：利用隐秘口袋筛选的小分子CP13实现中胰蛋白酶选择性抑制，为克服丝氨酸蛋白酶活性位点保守性难题提供解决方案。
3. 策略普适性：变构构象采样与隐秘口袋存在于多种S1蛋白酶（如凝血因子、类胰蛋白酶），且其低序列保守性为广谱选择性抑制剂开发奠定基础。

该研究不仅为癌症相关中胰蛋白酶的靶向治疗开辟新途径，更启示了一种可推广至整个S1蛋白酶家族的变构抑制策略，对治疗凝血障碍、炎症性疾病及感染性疾病具有深远影响。