基于液滴微流控技术检测血流感染中大肠杆菌罕见抗生素耐药亚群及其临床意义

本研究针对细菌异质性耐药(HR)检测难题，开发了基于液滴微流控的技术平台。通过将大肠杆菌与抗生素共封装于液滴，利用显微观测液滴收缩现象，实现了10?6频率耐药亚群的快速检测，仅需200-300个液滴即可完成，较传统PAP检测法灵敏度提升20000倍，为临床血流感染精准诊疗提供新工具。

　　

抗生素耐药性已成为现代医学面临的重大挑战，其中异质性耐药(heteroresistance, HR)现象尤为棘手——当主要敏感菌群中潜伏着极少量耐药亚群时，常规药敏检测(AST)往往漏检，导致治疗失败。世界卫生组织(WHO)重点病原体大肠杆菌(Escherichia coli)作为败血症主要致病菌，其HR表型与患者死亡率升高直接相关。传统群体分析图谱(PAP)检测虽为金标准，但存在耗时长(≥48小时)、操作繁琐等缺陷，临床亟需自动化快速检测方案。

为突破这一技术瓶颈，研究人员创新性地开发了液滴微流控检测系统。该技术将100-3000个细菌与抗生素共封装于180-220μm液滴中，通过显微观测代谢活跃液滴的5-10%收缩现象，实现耐药亚群识别。研究团队首先验证了液滴收缩与细菌生长的相关性：在无抗生素条件下，不同封装浓度(10⁴-5×10⁵ CFU/ml)的MG1655菌株均能引发特征性液滴收缩(图2)。随后用敏感菌株验证了2 mg/liter头孢噻肟(CTX)和0.5 mg/liter庆大霉素(GEN)完全抑制生长的阴性对照效果(图3)。

核心实验通过将敏感MG1655与耐药菌株按10^?3-10^?6梯度混合，证实该系统可精准检测三类抗生素耐药亚群：β-内酰胺类(CTX)、氨基糖苷类(GEN)和四环素类(TET)，实验检测频率与理论值误差<3倍(图4，表2)。在临床菌株验证中，对CTX-HR菌株DA63082和GEN-HR菌株DA63340的检测结果与PAP测试高度吻合(图5B-E)，且开发的多重检测芯片可同步分析CTX/GEN耐药性，准确区分非HR、CTX-HR和GEN-HR表型(图5G-I)。

关键技术包括：1) 3D打印微流控芯片实现细菌-抗生素共封装；2) 显微动态监测液滴尺寸变化；3) 自主开发的图像处理算法(高斯滤波-奥氏阈值-霍夫变换-分水岭分割)；4) 多重芯片设计实现并行检测。所用临床分离株来源于血流感染患者样本。

该研究突破性在于将检测灵敏度提升至10^?6水平，较单细胞封装技术减少99.995%液滴消耗，检测时间缩短至12-24小时。讨论部分指出，该系统仅需5μL抗生素溶液(较PAP节约5000倍)，且可通过声/电操控实现耐药菌分选。未来拓展至其他病原体-抗生素组合后，将助力大规模HR临床研究，为败血症精准治疗提供决策依据。论文发表于《Science Advances》，为应对全球耐药危机提供了创新技术解决方案。