通用型CAR-FAB模块化系统：癌症免疫治疗中的"即插即用"新策略

【编辑推荐】本研究针对传统CAR-T细胞疗法存在的抗原逃逸、毒性反应及制备复杂等问题，开发了基于工程化蛋白G变体(GA1)与抗体片段(Fab)的模块化CAR平台。该系统通过调节GA1CAR与Fab支架的亲和力实现T细胞功能的精准调控，在乳腺癌和卵巢癌模型中证实了多抗原靶向能力和治疗可重定向性，为个性化免疫治疗提供了更安全灵活的解决方案。

　　

癌症免疫治疗领域面临重大挑战：尽管嵌合抗原受体（CAR）T细胞疗法在血液肿瘤中取得突破，但实体瘤治疗仍受限于抗原异质性、靶向毒性和制备复杂性。传统CAR的单一靶向特性导致抗原逃逸复发，而scFv（单链抗体片段）结构的不可调控性可能引发细胞因子风暴等致命副作用。更棘手的是，每位患者都需要定制化生产，使得治疗成本高达数十万美元。这些瓶颈严重制约了CAR-T技术的广泛应用，亟需开发兼具安全性和灵活性的新型系统。

芝加哥大学的研究团队在《SCIENCE ADVANCES》发表的研究中，创新性地将蛋白质工程与免疫治疗相结合，开发出GA1CAR-FAB模块化系统。该系统核心是改造的蛋白G变体GA1，其通过定向进化消除了与天然抗体的交叉反应，仅特异性结合工程化的Fab支架。研究人员设计了LRT、SQRT和4D5三种不同亲和力的Fab支架（解离常数K_d分别为100 pM、10 nM和50 nM），将其与包含CD8铰链区、CD28跨膜域、41BB共刺激域和CD3ζ域的二代CAR结构融合。

关键技术包括：1）利用噬菌体展示技术筛选GA1特异性Fab突变体；2）表面等离子共振（SPR）测定蛋白相互作用动力学；3）流式细胞术分析CAR-T细胞表型；4）异种移植小鼠模型评估抗肿瘤效果；5）单分子下拉实验验证CAR二聚化结构。实验使用健康供体外周血单核细胞（PBMC）来源的CD8⁺ T细胞进行功能验证。

设计并构建GA1CAR系统
通过单分子光漂白分析证实GA1CAR以二聚体形式存在。流式检测显示，表达GA1CAR的Jurkat细胞对高亲和力Fab^LRT的EC₅₀达0.3 nM，显著优于低亲和力Fab^4D5（4.8 nM）。

GA1CAR的功能表征
在HEK-MBP模型中，Fab-抗原结合自由能的变化直接调控T细胞活化：添加10 mM麦芽糖使IL-2分泌降低15倍。原发性CD8⁺ T细胞实验显示，高亲和力Fab^LRT诱导的IFN-γ产量是低亲和力支架的8倍。

针对多种抗原和癌细胞系的细胞毒性
GA1CAR-T细胞通过不同Fab^LRT可特异性识别SKBR3（HER2⁺）和MDA-MB-468（EGFR⁺）乳腺癌细胞，对SKOV3ip卵巢癌细胞中低表达的MSLN和PRLR抗原也显示活性。值得注意的是，EGFR表达水平仅为HER2 1/10时仍能触发强烈杀伤。

可互换Fab支架的开关潜力
竞争实验证实，注射非靶向性Fab^LRT可快速（4小时内）阻断低亲和力Fab^SQLRT介导的细胞毒性，为临床提供安全调控手段。

GA1CAR在肿瘤异种移植模型中的体内疗效
在HCC1954乳腺癌模型中，GA1CAR-T联合Fab^LRT的抑瘤效果与传统scFv CAR-T相当（P<0.05）。独特的是，肿瘤复发后再次注射Fab^LRT可使已"休眠"50天的CAR-T细胞重新激活。

GA1CAR T和scFv CAR T细胞表型比较
RNA测序显示，GA1CAR-T在抗原刺激后激活标志物（CD137、PD-1）上调更显著，分泌IFN-γ和TNF的能力分别是scFv CAR-T的6倍和8倍。光谱流式分析发现，scFv CAR-T存在持续性CD25表达，提示基础信号泄漏。

用不同特异性的Fab^LRT重定向GA1CAR T细胞
序贯使用抗EGFR和抗HER2 Fab^LRT可使小鼠生存期延长超过46天，证实"即插即用"策略的可行性。

这项研究开创了CAR-T技术的新范式：GA1CAR系统通过正交蛋白相互作用解决了传统模块化CAR的结构限制，其核心优势体现在三个维度：1）安全性方面，Fab的半衰期约48小时，可通过竞争性置换快速终止毒性反应；2）灵活性方面，单个CAR-T产品可靶向多种抗原，降低生产成本；3）精准性方面，通过调整Fab-GA1亲和力实现治疗强度的梯度调控。

与需要蛋白酶切割的肽标签系统不同，GA1-Fab的天然蛋白互作具有更高稳定性。值得注意的是，该系统保留了与传统CAR相当的杀伤效力，同时避免了scFv结构导致的持续性激活。未来通过整合新一代共刺激域或自杀基因，可进一步拓展其临床应用场景。这项技术不仅为实体瘤治疗提供新工具，其模块化设计理念更为个性化医疗时代的"通用型"细胞药物开发指明了方向。