优化水稻田土壤RNA提取方法提升宏转录组测序质量的关键技术研究

本研究针对水稻田土壤中腐殖质等污染物导致RNA提取效率低下的难题，通过系统评估五种现有方法并优化Peng等（2018）的B3方案，创新性引入20% PEG沉淀技术，成功获得高纯度RNA（浓度>100 ng/μl，RIN>7）。该成果为解析稻田微生物组转录活性提供了可靠方法支撑，对推动精准农业研究具有重要意义。

　　

水稻作为全球半数人口的主粮，其产量提升与土壤微生物组功能密切相关。然而，稻田特有的黏土质地和高腐殖酸含量，使得微生物RNA提取成为制约宏转录组研究的瓶颈——传统方法获得的RNA常伴有严重色素污染，且完整性（RIN）普遍低于测序要求的阈值6。这一技术困境直接阻碍了科学家解析稻田微生物驱动氮循环、有机物降解等关键生态过程的分子机制。

马来西亚AIMST大学联合哥本哈根大学的研究团队在《BMC Research Notes》发表的研究中，创新性地优化了土壤RNA提取技术。研究人员从马来西亚霹雳州水稻田采集黏土样本，通过对比五种提取方法发现酚氯仿法的B3方案虽能保持rRNA完整性，但存在严重色素干扰。通过引入20% PEG-6000沉淀步骤，最终获得A260/A280达2.02±0.02的无色素RNA。宏转录组分析显示，该方法使细菌序列注释率提升至38.2%，显著优于常规方案。

关键技术包括：1）物理裂解结合溶菌酶处理增强微生物细胞破壁；2）双重酚氯仿抽提去除腐殖酸；3）20% PEG-6000选择性沉淀色素；4）Illumina NovaSeq 6000平台进行150 bp双端测序；5）Trinity v2.13.2进行转录本组装。

【方法优化】比较B1-B5五种方法显示，商业试剂盒（B4）虽无色素但产量不稳定（30.6 ng/μl），而酚氯仿法普遍产生黑色沉淀。凝胶电泳证实B3方案能保留23S/16S rRNA条带，但Qubit无法检测浓度，揭示色素干扰定量的问题。

【PEG优化】将B3方案的异丙醇沉淀替换为PEG后，20% PEG组合（mB3b）产生突破性改善：RNA浓度达104.5±0.5 ng/μl，RIN值7.55±0.25，显著优于30% PEG组的6.0。电泳显示清晰的rRNA条带且溶液完全透明。

【测序验证】mB3b样本产生55,210,358条高质量reads，经Trinity组装获得691,902个转录本。BUSCO评估显示33.9%的细菌保守基因完整度，比30% PEG组提高10.5个百分点。Kraken2分类证实其细菌注释率提升1.89%。

该研究建立了首个适用于高腐殖酸水稻土的标准化RNA提取流程，其创新性体现在：1）揭示PEG浓度与RNA完整性的非线性关系，20%为最优阈值；2）突破性解决色素吸附导致的定量偏差问题；3）为全球不同质地农田土壤的转录组研究提供可复制的技术框架。研究者已将方案成功应用于32个田块样本的宏转录组测序，数据已存入NCBI SRA（PRJNA770166），为后续研究稻田微生物功能提供了重要资源。值得注意的是，该方法仍存在样本量局限，未来需在更多土壤类型中验证其普适性。