CRISPRi介导分枝杆菌tkt基因敲降增强药用植物提取物的抗结核活性研究

本研究针对结核分枝杆菌（Mtb）固有耐药性导致的治疗难题，通过CRISPR干扰（CRISPRi）技术靶向沉默磷酸戊糖途径关键基因tkt，首次揭示其基因敲降可增强Croton gratissimus和Peltophorum africanum等植物丙酮提取物的抗分枝杆菌活性（MIC降低2倍）。分子对接证实提取物中活性成分（如根皮苷、三萜类）与分枝杆菌TKT（Rv1449c）、InhA（Rv1484）及KatG（Rv1908c）靶点结合力优于异烟肼，为开发基于植物化合物的抗结核新疗法提供双重靶向策略。

　　

论文解读

背景：耐药结核的突围之战
结核病（TB）作为全球致死率最高的传染病之一，其病原体结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）因细胞壁渗透性差、药物外排泵活跃及代谢可塑性等特性，导致现有疗法面临严峻耐药挑战。传统抗结核药物多靶向细胞壁合成或DNA复制，而分枝杆菌特有的代谢通路——如磷酸戊糖途径（PPP）中的转酮醇酶（Transketolase, TKT）——因其在碳代谢和阿拉伯糖前体合成中的核心作用，成为极具潜力的新靶点。与此同时，药用植物中结构多样的天然化合物为克服耐药提供了宝贵资源。南非林波波大学与斯泰伦博斯大学的研究团队创新性地将CRISPR基因调控技术与植物药理学结合，探索靶向代谢通路以增强植物提取物抗结核活性的新策略，成果发表于《BMC Complementary Medicine and Therapies》。

关键技术方法
研究团队通过三大实验模块揭示tkt靶点的治疗价值：

1. CRISPRi基因敲降系统构建：基于PLJR962质粒，设计靶向耻垢分枝杆菌（M. smegmatis）tkt基因（MSMEG_3103）的sgRNA，通过电穿孔技术构建可诱导型tkt敲降菌株。
2. 表型与药效评价：采用生长曲线、点板实验及微量肉汤稀释法，检测tkt敲降对细菌生长的抑制效应及对植物提取物（采自南非Lowveld植物园）的最低抑菌浓度（MIC）影响，并通过细胞毒性实验（Vero细胞MTT法）评估提取物安全性。
3. 活性成分作用机制解析：利用LC-MS鉴定提取物化学成分，结合分子对接（AutoDock 4.2）模拟活性分子与TKT（PDB:3RIM）、InhA（PDB:3FNG）及KatG（PDB:1SJ2）的相互作用。

研究结果

CRISPRi敲降tkt基因的有效性与表型验证
通过点板实验与生长曲线分析，研究发现500 ng/mL无水四环素（ATc）诱导的tkt基因沉默可显著抑制耻垢分枝杆菌生长（图1B,C）。RT-qPCR证实tkt转录水平下降（图2B），且生长抑制程度与ATc浓度呈正相关（图1D）。值得注意的是，即使低抑制强度（64.5倍）的sgRNA仍能有效阻断细菌增殖，证明tkt是维持分枝杆菌生存的关键脆弱靶点。

600显著降低；（D）ATc浓度梯度实验揭示剂量依赖性生长抑制。'>

植物提取物的抗分枝杆菌活性增效机制
在tkt敲降菌株中，C. gratissimus与P. africanum丙酮提取物的MIC值从1.25 mg/mL降至0.63 mg/mL（表1），活性提升2倍。生长动力学实验进一步显示，亚抑菌浓度（1 mg/mL）的提取物在ATc存在时对敲降株抑制率>75%（图3C）。这种增效作用具有选择性——标准药物（利福平、氨基苯并噻唑）未出现类似效应。

表1 植物提取物与药物对tkt敲降株的MIC（μg/mL）

物质	未敲降MIC	敲降后MIC
C. gratissimus	1250	630
P. africanum	1250	630

活性成分鉴定与多靶点作用机制
LC-MS从活性植物中鉴定出关键化合物（图5）：C. gratissimus的根皮苷（Phlorizin）、F. sur的三萜类、P. africanum的6-羟基飞燕草素-3-葡萄糖苷。分子对接显示，这些分子与TKT活性位点的结合能（-8.1至-9.6 kcal/mol）优于对照分子奥洛昔林A（-7.6 kcal/mol）。更值得注意的是，它们与耐药相关靶点InhA（Rv1484）和KatG（Rv1908c）的结合力均超过一线药物异烟肼（表3）：

• 根皮苷结合InhA（-9.7 kcal/mol）与KatG（-8.7 kcal/mol）
• F. sur三萜结合InhA（-9.9 kcal/mol）与KatG（-8.8 kcal/mol）

结论与意义
本研究首次证明CRISPRi介导的tkt基因敲降可显著增强药用植物提取物（尤其是C. gratissimus和P. africanum）的抗分枝杆菌活性，其机制可能源于代谢脆弱性与植物化合物的多靶点协同作用。通过LC-MS与分子对接联用技术，研究锁定根皮苷、三萜类及花青素衍生