pH梯度阳离子交换色谱法纯化IgG2二硫键异构体的创新策略及其功能影响研究

针对IgG2单抗二硫键异构体（IgG2-A/B）传统盐梯度纯化方法的局限性，Pfizer团队开发了pH梯度阳离子交换色谱技术，成功分离出IgG2-B含量20.3%至80.8%的天然态异构体，为评估不同异构体对药效（potency）的影响提供了新方法，发表于《Journal of Chromatography B》。

　　

论文解读
在生物制药领域，IgG2单克隆抗体（mAb）因其独特的二硫键异构体（disulfide isoforms）结构而备受关注。这些异构体——IgG2-A、IgG2-A/B和IgG2-B——通过铰链区二硫键的不同连接方式形成，直接影响抗体的功能。例如，IgG2-A因Fab区（抗原结合片段）灵活性增强而表现出更高的细胞表面受体亲和力，而IgG2-B则因其紧凑结构可能激活FcγR（Fcγ受体）非依赖的激动活性。然而，传统盐梯度阳离子交换色谱法对某些IgG2 mAb的纯化效果不佳，且高盐环境可能导致蛋白不稳定，阻碍了异构体功能研究的进展。

为解决这一难题，Pfizer的研究团队开发了一种创新的pH梯度阳离子交换色谱法。该方法成功分离了天然状态的IgG2异构体，克服了盐梯度法的局限性。研究使用的IgG2 mAb包含两条相同重链和κ轻链，分子量为146,822 Da，等电点（pI）为6.8。通过高分辨率变性反相色谱（reversed-phase chromatography）结合荧光检测，团队精确量化了各馏分中IgG2-B的含量（20.3%-80.8%），并证实所有样品均适用于药效测试。

关键方法

1. pH梯度阳离子交换色谱：以pH梯度替代盐梯度，实现IgG2异构体的温和分离；
2. 高分辨率反相色谱：分析馏分纯度及异构体比例；
3. 荧光检测技术：定量测定IgG2-B含量；
4. 结构表征：通过计算pI和分子量验证抗体特性。

研究结果

1. IgG2结构分析：铰链区四对二硫键的不同排列导致异构体结构差异，IgG2-A呈典型“Y”形，而IgG2-B更紧凑；
2. 分离效能：pH梯度法成功分离盐梯度法无法处理的mAb，馏分中IgG2-B含量跨度达60.5%；
3. 功能兼容性：纯化后样品杂质水平一致，可直接用于药效评估。

结论与意义
该研究首次将pH梯度阳离子交换色谱应用于IgG2异构体纯化，为难以通过传统方法处理的mAb提供了新解决方案。通过控制异构体比例，可系统研究其对药效的影响，例如IgG2-A的Fab区灵活性或IgG2-B的激动活性。这一技术不仅加速了IgG2治疗药物的开发，也为其他二硫键依赖性蛋白的分离提供了参考。研究发表于《Journal of Chromatography B》，作者包括Mark Chipley、Kristine Wells等，所有作者均声明为Pfizer员工。