优化慢病毒载体骨架诱导强效多样T细胞免疫以对抗肿瘤异质性

为解决肿瘤异质性导致的免疫治疗耐药问题，研究人员开发了非整合型慢病毒载体(LV)编码优化免疫原，通过加入蛋白酶体靶向序列和4-丙氨酸间隔增强了对显性和亚显性新抗原(neoepitopes)的T细胞应答。该研究证实27-mer天然序列比最小表位更具免疫原性，联合PD1阻断可显著抑制野生型MC38肿瘤生长，为个性化新抗原疫苗设计提供了重要参考。

　　

肿瘤免疫治疗面临的核心挑战是如何应对肿瘤细胞的异质性。随着高通量测序和表位预测技术的发展，针对患者特异性突变产生的新抗原(neoantigen)疫苗成为极具前景的策略。然而，肿瘤内部不断产生的基因突变形成了复杂的"马赛克"式异质性，这就要求免疫治疗必须覆盖足够多样化的新抗原谱系。此外，如何确保多表位疫苗中各个新抗原都能被有效加工呈递，避免免疫应答偏倚，也是亟待解决的技术难题。

来自Institut Pasteur等机构的研究团队在《npj Vaccines》发表的研究中，开发了基于非整合型慢病毒载体(LV)的优化疫苗平台。研究人员通过引入蛋白酶体靶向序列(泛素C或PEST序列)和设计4-丙氨酸疏水性间隔，显著增强了针对MC38和CT26结肠癌模型7-9个新抗原的CD8⁺ T细胞应答。特别值得注意的是，这种优化设计不仅提高了免疫反应强度，更关键的是拓宽了对亚显性表位的识别范围，为解决肿瘤异质性提供了新思路。

研究采用了多项关键技术：1)构建含不同间隔序列和靶向标签的LV载体；2)通过IFNγ ELISPOT和细胞内细胞因子染色评估T细胞反应；3)建立MC38稳定表达新抗原的肿瘤模型；4)利用NGS分析变体等位基因频率(VAF)追踪新抗原阳性细胞的清除情况；5)结合抗PD1检查点阻断评估协同治疗效果。

优化设计增强多新抗原呈递
研究人员设计了7种不同结构的LV载体，比较了泛素C、PEST靶向序列与不同间隔序列(4-甘氨酸、4-丙氨酸、SLVR)的组合效果。结果显示，含4-丙氨酸间隔的LV::A7和同时具有泛素C靶向的LV::UBA7诱导的T细胞反应最为强烈，特别是对亚显性表位Dpagt1和Aatf的识别显著增强。这种优化设计确保了各个新抗原都能被蛋白酶体有效加工，避免了免疫应答的偏倚。

抗肿瘤效果验证
在MC38稳定表达7种新抗原的模型中，LV::A7和LV::UBA7治疗组55天生存率显著提高，分别有57%和43%的小鼠获得完全缓解。值得注意的是，LV::UBA7治疗组小鼠对野生型MC38的再攻击表现出完全保护，显示其诱导了更全面的免疫记忆。对野生型MC38的治疗中，LV::UBA7显著延缓了肿瘤生长，且肿瘤浸润的CD8⁺ T细胞数量是LV::A7组的2倍。

27-mer序列的优势
将最小表位(8-10mer)扩展为包含天然侧翼序列的27-mer后，LV::conca-27诱导的T细胞反应多样性接近优化载体水平。这种设计不仅简化了新抗原定位流程，还确保了所有潜在的MHC-I和MHC-II表位都能被覆盖，为临床应用提供了便利。

新抗原特异性清除证据
通过VAF分析发现，治疗后肿瘤中Cpne1等新抗原突变频率显著降低，而TP53突变频率保持不变，证实疫苗诱导的T细胞能够特异性清除新抗原阳性细胞。转录组分析排除了新抗原表达下调的可能性，支持免疫选择压力导致突变克隆清除的机制。

联合治疗增效
LV::UBA7-27与抗PD1联合治疗组小鼠生存期显著延长，肿瘤生长抑制效果优于单药治疗。虽然未能实现完全缓解，但这一结果为克服肿瘤免疫抑制微环境提供了组合策略。

该研究的意义在于：1)建立了LV载体优化设计的标准流程，特别是阐明了4-丙氨酸间隔和蛋白酶体靶向序列的关键作用；2)证实27-mer设计在简化疫苗制备同时保持免疫原性的优势；3)通过VAF分析首次在动物模型中直观展示了新抗原特异性免疫清除的动态过程；4)为应对肿瘤异质性提供了"广谱覆盖"的疫苗设计范式。这些发现将推动个性化新抗原疫苗从实验室向临床转化，特别是针对高突变负荷的结直肠癌等恶性肿瘤。