重组无细胞系统中tRNA的连续原位合成实现稳态蛋白质翻译

本研究针对构建自再生合成细胞的关键挑战——tRNA的原位合成问题，开发了在PURE无细胞系统中连续合成21种tRNA的新策略。通过优化启动子设计、采用线性/环状DNA模板及tRNase Z处理技术，研究人员首次实现了稳态条件下tRNA合成与蛋白质表达的长期耦合，为构建自再生生物系统迈出重要一步。

　　

构建具有自再生能力的合成细胞是合成生物学领域的圣杯，而实现tRNA的原位合成则是其中关键瓶颈。传统无细胞蛋白质合成系统依赖外源添加的tRNA，这严重限制了系统的自我维持能力。虽然PURE（Protein synthesis Using Recombinant Elements）系统已能重建核心翻译机制，但tRNA的持续再生问题始终未能解决。现有技术面临三大挑战：非G起始tRNA的低效转录、3'端成熟度不足、以及转录与翻译的资源竞争。

瑞士洛桑联邦理工学院的研究团队在《Nature Communications》发表突破性成果，通过多管齐下的策略攻克了这些难题。他们首先优化了21种tRNA的体外转录（IVT）条件：对tRNA^Asn和tRNA^fMet进行定点突变，为tRNA^Ile和tRNA^Trp选用T7 class II 2.5启动子，其余采用T7 class III 6.5启动子。随后开发了两种原位合成路径：使用21个线性DNA模板（ltDNA）或单个经Nt.BspQI酶切的环状质粒。为处理3'端冗余，引入Thermotoga maritima来源的tRNase Z进行精确剪切。最终在微流控恒化器中实现了长达20小时的稳态蛋白质合成。

关键技术包括：1) 启动子工程优化IVT效率；2) 微流控恒化器实现反应物持续更新；3) 荧光报告基因（sfGFP/mCherry）定量监测；4) tRNA丰度调整模拟大肠杆菌天然比例；5) 适配体标记技术同步追踪mRNA/tRNA合成动态。

【Preparation of 21 IVT tRNAs】部分显示，通过启动子和模板优化，团队将tRNA^fMet_mut和tRNA^Asn_mut的产量分别提高56倍和33倍，tRNA^Ile和tRNA^Trp产量提升6倍和2倍。尿素凝胶电泳证实获得高纯度产物。

【Protein expression using 21 IVT tRNAs】结果表明，优化后的IVT tRNA混合物（0.5μg/μl）可产生17.9μg/ml sfGFP，达到商业大肠杆菌tRNA产量的7%。按天然比例调整tRNA丰度后，产量进一步提升至35.6μg/ml。

【Protein expression coupled with tRNA synthesis】证实线性DNA模板（168 nM）可在PURE系统中原位合成功能性tRNA，支持11.6μg/ml sfGFP表达。质粒模板方案中，经Nt.BspQI处理的"缺口质粒"表现出3-4倍于未处理质粒的活性。

【Use of T. maritima tRNase Z】部分创新性地利用嗜热菌tRNase Z处理前体tRNA，电泳显示其能精确切割3'端冗余序列。虽然处理后的tRNA活性仅为商业tRNA的8%，但证明了酶法成熟的可行性。

【Continuous steady-state synthesis】是研究的巅峰成果。在微流控恒化器中，150 nM ltDNA模板与0.4 nM sfGFP模板组合可维持17μg/ml的稳态表达（达商业tRNA水平的17.2%），而2.86 nM缺口质粒方案实现13.6μg/ml稳态输出。适配体实验首次量化了mRNA与tRNA合成间的资源竞争。

这项研究的意义在于：1) 首次实现全组tRNA的原位合成与翻译耦合；2) 开发出线性/环状模板双路径系统；3) 为合成细胞提供关键模块。特别值得注意的是，稳态微流控系统的建立突破了传统批量反应的时限限制，使系统向真正的自再生迈出实质性步伐。尽管当前IVT tRNA的翻译效率仍有提升空间，但该工作为后续整合DNA复制、氨基酸再生等模块奠定了坚实基础。从应用角度看，这项技术将推动遗传密码扩展、非天然氨基酸插入等领域的发展，也为研究tRNA修饰的功能影响提供了理想平台。