基于蛋白质语言模型的结构导向发现：高效稳定PET水解酶VenusMine平台的构建与应用

本研究针对塑料污染治理难题，开发了整合蛋白质语言模型(PLM)与结构相似性分析的VenusMine平台，从3300万候选蛋白中筛选出14种活性PET水解酶(PETase)。其中Kibdelosorangium banguiense来源的KbPETase在50℃下催化活性较标准酶IsPETase提升97倍，熔解温度(Tm)提高32℃，其催化效率(kcat/Km)超越FastPETase和LCC。该研究为工业级PET生物降解提供了新型酶工具，发表于《Nature Communications》。

　　

塑料污染已成为全球性环境危机，其中聚对苯二甲酸乙二醇酯(PET)作为最常见的包装材料，其耐久性导致自然环境中累积量超过5万亿件。传统机械化学回收方法存在高能耗、二次污染等问题，而现有生物酶解法受限于野生型PET水解酶(PETase)的低催化活性和热稳定性。虽然已有IsPETase、LCC等酶被发现，但其最适温度与工业需求(需接近PET玻璃化转变温度70℃)不匹配，且99%环境微生物不可培养的特性限制了新酶发现。

为解决这一难题，上海交通大学等机构的研究团队开发了VenusMine平台，通过整合FoldSeek结构搜索、MMseqs2序列检索和蛋白质语言模型ProstT5，构建了包含3300万候选蛋白的数据库。研究以IsPETase(PDB:5XFY)为模板，通过结构相似性分析和机器学习预测，最终筛选出34个候选酶进行实验验证。研究发现14种具有PET降解活性的酶，其中来源于Kibdelosorangium banguiense的KbPETase表现尤为突出：其晶体结构(PDB:9IW9)显示保守催化三联体(S128-H206-D176)，在50℃下对PET薄膜的降解活性比IsPETase高97倍，熔解温度(T_m)达80.1℃(比IsPETase高32℃)。与当前最优工程酶相比，KbPETase的催化效率(k_cat/K_m=0.263 mM^-1·s^-1)超越FastPETase(0.141)和LCC(0.208)，且在65℃下仍保持1.47倍于LCC的活性。该成果发表于《Nature Communications》，为工业级PET生物降解提供了全新酶资源。

关键技术方法包括：1) 基于FoldSeek和AlphaFold的结构相似性搜索；2) 采用ProstT5蛋白语言模型进行序列-结构嵌入和聚类分析；3) 通过ESM2预测熔解温度(T_m)和ProtSolM评估溶解度；4) 使用差示扫描荧光法(DSF)和纳米差示扫描量热法(nanoDSC)测定热稳定性；5) 超高效液相色谱(UPLC)定量PET降解产物TPA和MHET；6) 分子动力学(MD)模拟分析酶结构动态特性。

VenusMine：结构导向的酶发现平台
开发的双阶段筛选流程首先通过FoldSeek识别4235个结构相似蛋白，经MMseqs2扩展至3300万序列。ProstT5生成的蛋白嵌入经聚类分析后，选定含已知PETase的cluster 1/3进行后续筛选。

候选PET水解酶的特性分析
26个成功表达的蛋白中，14个显示酯键水解活性。pNPB检测和PET薄膜降解实验表明，8种酶的T_m比IsPETase高10℃以上，其中KbPETase在50℃下活性最显著。

KbPETase的高效催化与热稳定性
比较实验显示KbPETase在50℃时活性达IsPETase的97倍，65℃下仍优于LCC。动力学分析揭示其k_cat(0.270 s^-1)和K_m(1.04 mM)参数优势。

结构与分子动力学解析
1.75?分辨率晶体结构显示KbPETase保留IsPETase核心折叠但具有更紧凑的Rg分布(21.5±0.3?)。MD模拟发现其催化口袋氢键寿命(如N175-D205达5.00±0.21ns)显著长于对照酶。

该研究通过创新性地结合结构生物信息学与深度学习，突破了传统序列筛选的局限性。KbPETase的发现不仅提供了目前性能最优的野生型PETase，其模块化筛选平台VenusMine更可拓展至其他工业酶发掘领域。研究揭示的"全局刚性-局部柔性"结构特征(盐桥数比IsPETase多37%)为理性设计热稳定酶提供了新思路。相较于需要复杂改造的工程酶(如LCC^ICCG)，这种天然高性能酶大幅降低了工业化应用门槛，有望推动PET生物回收技术向低成本、低能耗方向发展。