基于大正则非平衡候选蒙特卡洛方法的片段药物发现加速技术研究

本研究针对片段药物发现(FBDD)中传统分子动力学(MD)采样效率低、结合模式预测不准确等问题，开发了大正则非平衡候选蒙特卡洛(GCNCMC)方法。该方法通过μVT系综的分子插入/删除机制，实现了对蛋白结合位点的高效识别、多结合模式的自动采样及结合自由能的精确计算，无需人工约束或对称性校正。实验验证显示，GCNCMC在T4L99A和MUP1蛋白体系中预测的结合位点与晶体结构一致，结合自由能计算结果与金标准ABFE方法高度吻合(MAE=0.7 kcal mol-1)，为FBDD提供了全新计算工具。

　　

在药物研发的早期阶段，片段药物发现(Fragment-Based Drug Discovery, FBDD)因其能高效探索化学空间而备受青睐。然而，传统实验方法如X射线晶体学(XRC)难以检测毫摩尔级(KD)弱结合片段，而计算工具如分子对接常因忽略蛋白动态性产生假阳性。更严峻的是，分子动力学(MD)模拟受限于微秒级时间尺度，难以观测到片段在溶剂不可及口袋的自发结合事件。这些瓶颈严重制约了FBDD的效率，亟需开发能突破时间尺度限制、自动采样多结合模式的计算新方法。

针对这一挑战，英国南安普顿大学的研究团队将此前用于水分子采样的大正则非平衡候选蒙特卡洛(Grand Canonical Nonequilibrium Candidate Monte Carlo, GCNCMC)方法拓展至片段领域。该方法通过在μVT系综中执行片段插入/删除的"非平衡切换"，结合热力学接受准则，实现了对蛋白结合位点的"诱导契合"式采样。研究以T4溶菌酶突变体(T4L99A)、主要尿蛋白1(MUP1)和β-环糊精(βCD)为模型系统，验证了GCNCMC在结合位点预测、多结合模式采样及自由能计算方面的卓越性能，相关成果发表于《Nature Communications》。

关键技术方法包括：1)构建μVT系综的GCNCMC算法框架，通过Adams值(B_eq)调控片段浓度；2)采用软核Lennard-Jones势函数处理非平衡切换中的非物理态；3)基于逻辑函数拟合滴定曲线，直接从50%结合 occupancy对应的B₅₀值推导解离常数(K_D)；4)结合AMBER ff14SB、GAFF力场与TIP3P水模型进行全原子模拟。

高效识别溶剂不可及结合位点
通过对比传统混合溶剂分子动力学(MSMD)与GCNCMC增强的MSMD，研究发现苯在T4L99A疏水腔的占据率从MD的<1%提升至GCNCMC的90%（

）。对MUP1的三配体体系，GCNCMC同样准确预测了晶体结合位点，而传统MD因配体聚集完全失效。

自动采样多结合模式
在βCD-苯甲腈体系中，GCNCMC无需预设即正确捕获了极性基团朝次级醇端口的优势取向（

）。对T4L99A-甲苯体系，该方法重现了晶体构象(A1/A2)与亚稳态构象(B1/B2)的69:31比例，与BLUES方法结果一致，且自动处理了C₂对称性校正问题。

精确计算结合自由能
通过滴定B_eq值获得的22个βCD-配体结合自由能，与实验值平均绝对误差仅0.7 kcal mol^-1（

）。在蛋白体系中，GCNCMC与绝对结合自由能(ABFE)计算结果高度相关(R²=0.812)，且无需人工设定约束或单独计算各结合模式贡献。

该研究突破了传统FBDD的计算瓶颈：1)GCNCMC的插入/删除机制将毫秒级结合事件压缩至纳秒级模拟；2)非平衡切换自动诱导蛋白构象变化，解决了刚性对接的局限性；3)热力学接受准则天然整合多结合模式与溶剂效应。尽管在涉及大尺度构象变化的体系仍需改进，该方法为"无先验知识"的药物设计提供了新范式。工业界已开始应用该技术，如Astex制药公司通过CCP5联盟资助本研究，突显其转化价值。未来通过耦合FAST等增强采样技术，GCNCMC有望在膜蛋白等复杂靶点的片段筛选中发挥更大作用。