无滤纸泡沫薄膜冷冻电镜制样技术：实现冰层厚度可控与颗粒取向优化

冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析面临冰层厚度不均、气-水界面（air-water interface）相互作用及颗粒取向偏好三大挑战。剑桥分子生物学实验室团队开发了一种基于表面活性剂稳定的泡沫薄膜（surfactant-stabilised foam films）的无滤纸玻璃化技术，实现了冰层厚度均匀化（约50 nm）、厚度可调控及颗粒取向分布效率提升（如过氧化氢酶取向效率从0.15升至0.8）。该方法简化了样本制备流程，减少颗粒在载网碳膜上的吸附，为高分辨率结构解析提供了新工具。

　　

论文解读

在结构生物学领域，冷冻电镜（cryo-EM）技术革命性地推动了生物大分子高分辨率结构的解析。然而，其样本制备环节长期存在三大瓶颈：冰层厚度不一致、气-水界面（air-water interface）引起的分子变性或吸附损失，以及颗粒取向偏好导致的成像偏差。传统滤纸吸除法（blotting）依赖经验性操作，难以精确控制厚度，且无法避免气-液界面破坏作用。尽管近年涌现了喷墨打印、电喷雾等技术，但这些方法仍面临设备复杂或通量限制。如何实现简单、可控且普适的样本制备，成为领域内亟待突破的难题。

为此，剑桥分子生物学实验室的Yue Zhang、Biplob Nandy等研究人员联合开发了一种创新的泡沫薄膜玻璃化技术（foam film vitrification）。该方法将生物样本与表面活性剂（如DDM、脂质）混合，通过铜环浸渍形成双面覆盖表面活性剂的自由悬浮泡沫薄膜。薄膜在重力、蒸发和边缘再生（marginal regeneration）作用下逐渐变薄，厚度可通过激光干涉测量或可见光干涉色带实时监测（图1）。当达到目标厚度（通常50–100 nm）时，薄膜被转移至电镜载网并投入液态乙烷实现玻璃化（图1A）。团队设计了专用样本容器（20 μL容积）和载网弯曲装置（15°倾角），确保薄膜完整转移（图1B–F）。该成果于2025年7月发表于《Nature Communications》。

关键技术方法

研究通过以下核心实验验证方法：（1）利用最大气泡压力法测量表面活性剂动态表面张力，筛选兼容性试剂（如DDM）；（2）激光干涉测量（图4A–B）实时监测泡沫薄膜变薄动力学；（3）冷冻电子断层成像（cryo-ET）量化冰层厚度，关联激光预测量数据；（4）对过氧化氢酶（catalase）、30S核糖体（30S ribosomes）、EspB蛋白等七种生物大分子进行单颗粒冷冻电镜解析，评估取向分布效率（orientation distribution efficiency）和分辨率。

研究结果

泡沫薄膜玻璃化实现冰层均匀化且不受载网亲疏水性影响

与传统方法相比，泡沫薄膜技术在Quantifoil和UltrAufoil载网上均产生厚度一致的冰层（图1G–H）。通过半辉光放电载网对比实验（图2A），证实亲水（接触角18°）与疏水（接触角90°）区域冰层分布无显著差异（图2B–G），表明该方法摆脱了对载网润湿性的依赖。

表面活性剂筛选与薄膜动力学调控

动态表面张力测试显示，DDM和06:0 PC在临界胶束浓度（CMC）处显著降低表面张力，而LMNG和12:0 PC效果不佳（图3A–B）。激光干涉实验表明，高湿度（95%）和蛋白质（如EspB）添加可减缓薄膜变薄速度（图4E–F），为厚度精准控制提供参数依据。

预厚度测量与最终冰层厚度相关性验证

通过冷冻电镜与激光干涉数据关联分析（图5A–D），证实泡沫薄膜预厚度（激光测量）与玻璃化后冰层厚度（电镜测量）呈线性相关（R²=0.824），验证了该方法的可预测性。

高分辨率结构解析与取向优化

应用泡沫薄膜技术成功解析了七种生物大分子结构（分辨率2.3–3.5 ?，图6），包括：

• 过氧化氢酶：取向效率从传统方法的0.15（无表面活性剂）提升至0.8（图6B–D）；
• 30S核糖体：泡沫薄膜联合DDM使取向效率达0.64，与传统方法加DDM相当（图6F–H）；
• EspB蛋白：DDM泡沫薄膜将取向效率从0.04（传统+DDM）提升至0.77（图6J–L）；
• 膜蛋白AcrB：实现均匀孔内颗粒分布（图S14）。

结论与意义

泡沫薄膜玻璃化技术通过表面活性剂稳定气-液界面，显著减少了颗粒吸附和取向偏好，同时实现冰层厚度的主动调控。该方法解决了传统制样中的三大核心问题：

1. 简化流程：无需滤纸吸除和辉光放电，降低操作复杂性；
2. 提升兼容性：适用于膜蛋白、组织源性tau蛋白纤维等难处理样本；
3. 改善数据质量：提升取向分布效率和孔内颗粒均匀度（图S13–S14）。

尽管存在背景信号增加（高浓度表面活性剂胶束）和强界面亲和蛋白（如FtsZ）适用性局限（图S16），该技术为冷冻电镜样本制备提供了新范式。未来通过整合脂质单层（Langmuir-Blodgett films）等强化界面保护层，有望进一步拓展其应用广度，推动原子分辨率结构生物学研究。