基于双自引发发夹探针的等温扩增技术实现循环肿瘤DNA无标记荧光超敏检测

为解决乳腺癌循环肿瘤DNA(ctDNA)早期检测灵敏度不足和传统SDA(链置换扩增)技术背景信号高、成本昂贵等问题，西南大学团队开发了双自引发发夹(DSH)探针介导的等温扩增系统。该技术通过G-四链体(G4)/硫黄素T(ThT)复合物实现无标记荧光检测，灵敏度达19.1 aM，为液体活检提供了新型经济高效的检测平台。

　　

在癌症诊疗领域，液体活检技术正掀起一场革命。其中，循环肿瘤DNA（ctDNA）如同肿瘤释放的"分子指纹"，能够实时反映肿瘤负荷和治疗反应。然而，早期乳腺癌患者血液中ctDNA浓度极低（皮摩尔至飞摩尔级），且半衰期短暂，犹如大海捞针。更棘手的是，三阴性乳腺癌（TNBC）缺乏有效靶向治疗手段，患者主要依赖创伤性组织活检进行监测。传统检测方法面临双重困境：一方面，链置换扩增（SDA）技术因多引物非特异性杂交导致背景干扰；另一方面，依赖双标记分子信标的荧光检测使成本居高不下。

西南大学化学化工学院的研究团队在《Sensors and Actuators B: Chemical》发表的研究中，创新性地将双自引发发夹（DSH）探针与G-四链体（G4）荧光增强效应相结合，构建了超灵敏检测平台。该研究采用血清样本，通过三个关键技术突破检测瓶颈：首先设计含Nb.BbvCI内切酶识别序列的DSH探针，实现靶标触发的构象转换；其次利用发夹结构的空间位阻效应抑制非特异性扩增；最后通过G4/ThT复合物实现2100倍荧光增强的无标记检测。

^{SDA辅助信号放大实验}
研究团队首先在含20 mM Tris-HCl、10 mM MgCl₂的缓冲体系中构建DSH探针。温度梯度退火形成的双发夹结构中，H1含靶标识别区（蓝色）和Nb.BbvCI切割位点（黄色），H2则携带G-rich序列。当靶ctDNA存在时，引发级联反应：H1构象变化暴露3'端引发链置换扩增（SDA），同时释放H2启动次级扩增，最终产生大量G-rich单链。

^{方法设计原理}
该系统的精妙之处在于"双触发-双放大"机制。单个ctDNA分子可诱导两个发夹探针依次启动SDA反应，每个循环产生约10⁷倍放大。G-rich产物与ThT结合后，荧光强度与ctDNA浓度在100 fM-100 nM范围内呈线性相关，最低检测限达19.1 aM（约每微升数个分子）。这种设计避免了SYBR Green II等染料的非特异性结合问题。

^结论
该研究实现了三项重要突破：一是将检测灵敏度提升至阿托摩尔级；二是通过发夹探针设计将引物成本降低95%；三是建立通用化检测平台，仅需更换探针识别序列即可检测PIK3CA等不同基因突变。Nian Bing Li团队的工作为癌症早诊提供了兼具超敏性、经济性和便捷性的新工具，特别适合医疗资源匮乏地区的推广应用。

^{讨论与展望}
相比传统SDA技术，该方法的背景信号降低约80%，且无需复杂仪器，在血清样本中回收率达92.4-106.3%。未来通过微流控芯片集成，有望实现床旁检测。值得注意的是，G4/ThT体系的稳定性解决了常温运输难题，这对推动液体活检技术下乡具有重要实践意义。正如研究者所言，这项技术不仅适用于乳腺癌，更为多种癌症的分子分型提供了普适性检测框架。