系统改造恶臭假单胞菌合成丝氨酸循环实现甲醇高效同化的新兴代谢拓扑结构研究

本研究针对一碳(C1)化合物同化效率低下的问题，通过模块化工程策略在恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)中构建了三种合成丝氨酸循环(SC)变体（STC/HSC/mSC），结合内源PQQ依赖型甲醇脱氢酶(PQQ-MeDH)的调控，揭示了增强型丝氨酸-苏氨酸循环(eSTC)的新型代谢架构，为异养细菌的C1同化提供了工程蓝图，相关成果发表于《TRENDS in Biotechnology》。

　　

随着气候变化危机加剧，开发基于可再生资源的生物制造技术迫在眉睫。一碳(C₁)化合物如甲醇和甲酸，因其可从废弃CO₂转化获得且不占用粮食资源，成为理想的可持续底物。然而，天然甲基营养菌难以改造，而常用模式生物如大肠杆菌缺乏C₁同化能力。恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)凭借其卓越的代谢灵活性和环境适应性，成为极具潜力的非模式宿主，但其甲醇同化能力尚未开发。

丹麦技术大学诺和诺德生物可持续中心的Pablo I. Nikel团队通过系统改造P. putida的代谢网络，构建了三种合成丝氨酸循环(SC)变体：丝氨酸-苏氨酸循环(STC)、高丝氨酸循环(HSC)和修饰丝氨酸循环(mSC)。研究采用生长偶联选择和模块化工程策略，将代谢途径分解为C₁同化模块(M1)和C₃羧化模块(M2)，通过基因组整合和质粒过表达实现了甲醇依赖的生长。令人振奋的是，结合内源吡咯喹啉醌(PQQ)依赖型脱氢酶和新型代谢拓扑结构，研究者意外发现了增强型STC(eSTC)，显著提升了甲醇利用效率。该成果发表于《TRENDS in Biotechnology》，为异养细菌的C₁代谢工程提供了创新范式。

研究采用的关键技术包括：1) 最大-最小驱动力(MDF)分析和通量平衡分析(FBA)指导途径设计；2) 基因组精简菌株SEM11作为工程平台；3) 启动子工程调控内源pedE/pedH基因表达；4) Tn5转座子介导的基因随机整合；5) 荧光报告系统监测代谢通量。通过计算与实验的协同优化，实现了代谢途径的理性设计。

模块化工程揭示代谢拓扑
研究将三种SC变体分解为功能模块进行系统比较。M1模块测试显示，来自大肠杆菌的L-苏氨酸醛缩酶(EcLtaE)在甲醛同化中表现最优，而内源PQQ-MeDHs通过yiaY过表达可显著提升甲醇氧化效率。M2模块中，STC依赖内源LtaE实现甘氨酸再生，mSC则需要异源丙氨酸-乙醛酸转氨酶(Agt)和苹果酰辅酶A裂解酶(Mcl)的引入。模块组合实验表明STC最具工程潜力。

内源脱氢酶的调控奥秘
研究首次揭示了P. putida中PQQ-MeDHs的调控机制。通过构建pedE/pedH启动子与msfGFP的融合报告系统，证实yiaY过表达可突破稀土元素(REE)的调控限制，在多种C₁底物下持续激活脱氢酶表达。这一发现为利用内源酶系统提供了关键调控策略。

增强型循环的意外发现
在完整STC菌株中引入M1·HSC的丝氨酸醛缩酶活性，意外构建出eSTC。该变体通过增加甲醛直接同化节点，使菌株在500 mM甲醇下的生物量提高16%，迟滞期缩短25%。点突变体EcLtaE*(C188Y)进一步优化了催化效率。

这项研究通过创新性地整合合成生物学与系统代谢工程，在非模式宿主中实现了高效的C₁同化。eSTC的发现不仅拓展了合成代谢的理论边界，更展示了模块化工程在解锁微生物新功能中的强大潜力。该工作为开发基于甲醇的生物制造平台提供了关键技术支撑，对推动碳循环经济具有重要意义。研究者特别指出，未来需重点优化途径能量平衡和规模化稳定性，以加速该技术向工业应用的转化。