利用MCMS文库定向进化新型AAV变体以增强小鼠中枢神经系统趋向性并减少肝脏靶向

本研究针对AAV9通过血脑屏障(BBB)递送效率不足及肝脏靶向性过高的问题，开发了多策略突变文库(MCMS)，通过插入和替换策略成功筛选出中枢神经系统(CNS)趋向性显著增强的BRC06变体。该变体在BALB/c小鼠中实现脑部转染效率提升1482倍且肝脏靶向降低92倍，为神经系统疾病基因治疗提供了高效递送工具。

　　

基因治疗领域面临着一个关键挑战：如何让治疗基因高效穿越血脑屏障抵达中枢神经系统，同时避免在肝脏等非靶器官的蓄积。天然AAV9虽具有一定穿透血脑屏障的能力，但其递送效率远未达到治疗需求。更棘手的是，高剂量注射时90%以上的病毒颗粒会富集在肝脏，这不仅造成药物浪费，更可能引发肝毒性。现有通过VR-VIII区插入7肽的改造策略成功率不足1%，且多数变体存在显著的品系特异性——例如明星变体AAV.PHP.eB在C57BL/6J小鼠效果显著，却在BALB/c小鼠中几乎失效。

西湖大学的研究团队创新性地构建了多策略突变文库(MCMS)，通过8种不同的VR-VIII区改造策略（包括4种侧翼序列插入和4种替换策略），成功筛选出具有跨品系高效递送能力的BRC06变体。该研究发表在《Molecular Therapy Methods》期刊，为解决神经系统基因递送难题提供了新方案。

研究采用三项关键技术：1）构建包含1.28亿变体的MCMS文库，通过NNK密码子实现7肽随机突变；2）在C57BL/6J和BALB/c小鼠中进行三轮体内筛选，结合NGS分析富集变体；3）全基因组CRISPR筛选鉴定BRC06入胞关键宿主因子。实验使用8周龄小鼠，通过尾静脉注射5×10¹¹ vg/只的剂量评估体内分布。

研究结果揭示：

1. MCMS文库设计
   通过比较8种子策略发现，AQAQ四残基替换策略(Sub2)贡献了38%的TOP100变体，而传统7肽插入策略(Sub4)仅占9%。

   
   显示BRC06源自Sub2策略，其独特SGxG糖基化模体可能促进免疫逃逸。

2. 体内递送效能
   在BALB/c小鼠中，BRC06实现脑部EGFP mRNA表达提升1482倍，肝脏表达降低92倍。

   
   显示其脊髓转染效率达AAV9的834倍。低剂量(5×10¹⁰ vg)实验证实其维持高效CNS递送能力。

3. 作用机制解析
   CRISPR筛选发现BRC06依赖AAVR入胞，但Acp2基因敲除使其转染效率下降更显著（较AAV9降低40%），提示该溶酶体酸性磷酸酶在胞内运输中起关键作用。结构预测显示其VR-VIII区构象改变可能影响宿主互作。

这项研究突破了传统AAV改造策略的局限性：首先，MCMS文库的多元设计使CNS高效变体发现率提升4倍；其次，BRC06在两种品系小鼠中均保持优异性能，解决了AAV.PHP.eB的品系限制；更重要的是，其肝脏脱靶率创下新低，为安全给药提供保障。研究还揭示了糖基化修饰可能影响病毒穿越BBB的新机制，为下一代载体设计提供理论依据。这些发现不仅推进了神经退行性疾病的基因治疗进程，其文库构建策略更可拓展至其他组织靶向载体的开发。