"选择与重测序"技术实现双态人类致病真菌粗球孢子菌全基因组关联研究

研究人员针对非模式生物表型-基因型关联研究的瓶颈，创新性开发基于混合培养和测序的"选择与重测序"方法，以粗球孢子菌(C. posadasii)温度依赖性生长为模型，通过GWAS分析发现Ryp1调控网络关键基因D8B26_001557的变异与表型关联，为病原真菌遗传机制研究提供新范式。

　　

在真菌病原体研究领域，粗球孢子菌(Coccidioides posadasii)作为引起山谷热(Valley Fever)的病原体，其独特的双态生活史——在环境中以菌丝体生长，在哺乳动物宿主体内转化为致病性球形体——的分子机制仍知之甚少。这种生物安全三级(BSL-3)病原体的研究受限于严格的实验室条件，传统遗传筛选方法难以实施。更关键的是，目前仅发现10个与毒力相关的基因，且多数是通过同源比对或其他真菌的研究经验推测而来。如何突破表型检测的瓶颈，建立高效的非模式病原体基因型-表型关联研究方法，成为亟待解决的科学问题。

针对这一挑战，美国加州大学旧金山分校等单位的研究团队创新性地将"选择与重测序"(Select and Resequence)策略应用于粗球孢子菌研究。他们以温度响应性生长这一与致病性密切相关的表型为切入点，通过对自然变异菌株的混合培养和基因组规模分析，成功鉴定了调控网络关键基因D8B26_001557的变异与生长表型的关联。这项发表于《Genome Biology and Evolution》的研究，首次实现了在该病原体中全基因组水平的功能遗传学筛查。

研究团队运用三项关键技术：首先采集66株临床分离株进行全基因组测序，构建系统发育树；其次开发基于二项式模型的生物信息学方法，通过模拟退火算法从混合培养测序数据中解析单菌株丰度；最后采用线性混合模型(LMM)进行GWAS分析，校正种群结构影响。所有实验均在生物安全三级条件下完成，使用来自亚利桑那州皮马县的临床菌株队列。

测序遗传差异显著的粗球孢子菌临床分离株
通过构建包含77株临床分离株的基因组数据集，系统发育分析显示这些菌株来自至少三个已知种群。选择54株发芽良好的菌株建立实验体系，温度响应性生长被确立为可量化且具有菌株间变异的理想表型模型。

混合培养池可通过二项式模型解析
研究团队改进了HARP软件包的计算方法，建立基于最大似然估计的菌株丰度推断模型。通过模拟包含54株菌的混合培养数据验证，该方法能以<1%的绝对误差解析菌株比例，仅对克隆菌株存在识别局限。

从实验性混合测序推断菌株丰度
在37°C和室温(RT)条件下进行12组混合培养实验，测序数据显示37°C培养的菌株丰度变异更大。显著性检验鉴定出7株温度敏感性显著差异的菌株，以及2株温度不敏感的超适应菌株。

GWAS应用
以温度依赖性生长（log₂(RT/37°C丰度比)）为表型进行关联分析，发现12个通过10%错误发现率的SNP均位于未知功能基因D8B26_001557内。该基因在致病球形体阶段特异性高表达，且受双态发育主调控因子Ryp1直接调控。非同义突变形成三种单倍型：A单倍型(16株)与RT生长优势相关，C单倍型(18株)与37°C适应相关，B单倍型(1株)为重组中间型。值得注意的是，近缘种C. immitis中该基因序列高度保守，提示其在粗球孢子菌中的特异性进化。

这项研究开创性地将群体遗传学与功能基因组学方法相结合，解决了非模式病原体遗传研究的重大技术瓶颈。发现Ryp1调控网络新成员D8B26_001557与温度适应的关联，不仅完善了对真菌双态转换分子机制的认识，更建立了可推广的研究范式。该方法可扩展至其他难以操作的病原系统，为毒力因子鉴定和宿主适应机制研究提供强大工具。特别值得注意的是，由于Ryp1调控网络在多种致病真菌中保守，该发现可能具有跨物种的生物学意义。未来研究可进一步验证D8B26_001557在宿主感染过程中的具体功能，并探索该方法在更多表型筛选中的应用潜力。