"LUPP-LAMP：一种基于连接酶介导的通用引物探针多重等温扩增技术实现登革热与寨卡病毒同步检测与分型"

本研究针对登革热病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)早期鉴别诊断难题，开发了基于连接酶介导的通用引物探针(LUPP-LAMP)技术。该技术通过Splint R DNA连接酶实现单管多重检测，灵敏度达10拷贝/反应，并创新性整合侧向层析试纸条和熔解曲线分析(MCA)，为资源有限地区提供快速精准的POCT解决方案。

　　

在热带和亚热带地区，由埃及伊蚊传播的登革热病毒(DENV)和寨卡病毒(ZIKV)感染常引发相似的发热、关节痛等症状，每年导致数亿人感染。这两种病毒的早期鉴别诊断面临重大挑战：传统RT-PCR需要精密仪器和严格实验室条件，而现有等温扩增技术存在引物二聚体形成、非特异性扩增等问题。更棘手的是，寨卡病毒感染可能引发新生儿小头症和格林-巴利综合征，登革热不同血清型(1-4型)的混合感染又增加了流行病学监测的复杂性。

为解决这些难题，海南医科大学第一附属医院等机构的研究团队在《Journal of Nanobiotechnology》发表研究，开发出连接酶介导通用引物探针环介导等温扩增技术(LUPP-LAMP)。该技术通过三大创新突破技术瓶颈：首先利用Splint R DNA连接酶在常温下连接通用引物探针，避免复杂引物设计；其次采用RNase H₂水解RNA修饰探针实现实时信号输出；最后整合侧向层析试纸条和熔解曲线分析(MCA)实现多重检测与分型。

关键技术方法包括：1) 基于病毒保守序列设计连接寡核苷酸和通用LAMP引物；2) 建立单管反应体系整合连接酶、Bsu DNA聚合酶和RNase H₂；3) 开发双标记探针系统实现熔解曲线分型；4) 采用临床模拟样本验证性能。

主要研究结果

Construction and analytical performance of LUPP-PCR
通过Sanger测序和毛细管电泳验证连接产物，优化反应参数后建立LUPP-PCR体系。该系统对DENV/ZIKV的检测限达10拷贝/反应，线性范围1E1-1E6拷贝/反应(R²=0.99)，可识别1000:1比例的混合感染。

Construction and analytical performance of warm-start LUPP-LAMP
筛选Bsu DNA聚合酶在等温缓冲液中表现最佳，确定0.2 mM dNTPs和2.5 mM Mg²⁺为最优条件。相比三步法，单管反应将检测限提高10倍至1E2拷贝，扩增效率达1.1×10⁹倍。

Analytical performance of RNase H₂ probe assistant LUPP-LAMP
RNase H₂探针系统对DENV/ZIKV的检测限分别为7.2和6.5拷贝/反应，荧光成像显示共感染时黄绿色信号融合。24例模拟临床样本检测结果与PCR完全一致。

Lateral flow LUPP-LAMP assay for point-of-care testing
侧向层析试纸条在10拷贝/反应阈值下实现目视判读，UNG酶有效防止扩增产物污染。ROC曲线显示DENV/ZIKV的AUC值达0.960和0.953。

LUPP-LAMP MCA assay for DENV genotyping
通过设计Tm标签探针，熔解曲线成功区分DENV 1-4型，四重混合感染时出现44.1°C、55.1°C、60.7°C和65.4°C特征峰。

该研究突破传统LAMP技术局限：连接酶介导的通用引物设计将反应温度降至25-37°C；RNase H₂探针替代CRISPR系统降低成本；单管多重检测避免交叉污染。特别值得注意的是，该技术首次实现DENV血清型熔解曲线分型，为流行病学研究提供新工具。研究者建议未来在真实临床样本中验证性能，并探索其在其他虫媒病毒检测中的应用潜力。这项技术有望重塑资源有限地区的病毒诊断范式，为全球传染病防控提供关键技术支撑。