TTK通过磷酸化RPA2激活ATR信号通路促进卵巢癌对奥拉帕尼耐药机制研究

本研究针对卵巢癌(OC)患者对PARP抑制剂(如奥拉帕尼)产生耐药性这一临床难题，揭示了TTK蛋白激酶通过磷酸化RPA2第33位丝氨酸(S33)激活ATR信号通路的关键机制。研究人员通过体内外实验证实，TTK抑制剂可显著增强HR功能正常卵巢癌细胞对奥拉帕尼的敏感性，为克服PARPi耐药提供了新的联合治疗策略。该发现对改善卵巢癌患者预后具有重要临床意义。

　　

卵巢癌作为妇科恶性肿瘤中死亡率最高的疾病，5年生存率仅约30%。虽然PARP抑制剂奥拉帕尼等药物显著改善了患者的无进展生存期，但耐药性问题日益突出。目前已知的耐药机制包括PARP捕获减少、同源重组修复(HR)功能恢复、复制叉保护等，但仍有大量未知机制亟待阐明。山东大学的研究团队在《Communications Biology》发表的研究，首次揭示了TTK蛋白激酶通过RPA2/ATR信号通路介导PARP抑制剂耐药的新机制。

研究采用的主要技术包括：基因敲降(shRNA)和过表达技术建立细胞模型；MTT法和克隆形成实验评估药物敏感性；免疫共沉淀(Co-IP)和质谱分析鉴定蛋白相互作用；免疫荧光检测DNA损伤标志物γH2AX和修复蛋白RAD51 foci；碱性彗星实验评估DNA损伤程度；以及裸鼠移植瘤模型验证体内疗效。

【TTK促进卵巢癌细胞对奥拉帕尼耐药】
研究人员首先在HR功能正常的OVCAR8、OV90细胞和奥拉帕尼耐药SKOV3/OLA细胞中发现，TTK敲降显著增强了细胞对奥拉帕尼的敏感性，而TTK过表达则诱导了HR缺陷型UWB1.289细胞的耐药性。两种TTK抑制剂CFI-402257和BAY1161909均能有效增强奥拉帕尼的细胞毒性作用。

【TTK直接与RPA2相互作用】
通过质谱分析和免疫共沉淀实验，研究团队首次证实TTK与复制蛋白A2(RPA2)存在直接相互作用。免疫荧光和邻近连接实验(PLA)显示两者在细胞核内共定位。值得注意的是，奥拉帕尼处理增强了TTK-RPA2相互作用，而TTK抑制剂则减弱了这种结合。

【TTK磷酸化RPA2的S33位点】
深入机制研究发现，TTK特异性磷酸化RPA2第33位丝氨酸(S33)，而对S4/8位点的磷酸化无影响。体外激酶实验进一步证实了这一发现。构建的RPA2 S33A突变体无法被磷酸化，而奥拉帕尼诱导的RPA2磷酸化可被TTK抑制所阻断。

【RPA2沉默增强奥拉帕尼敏感性】
RPA2敲降显著提高了卵巢癌细胞对奥拉帕尼的敏感性，表现为γH2AX foci增加、RAD51 foci减少以及彗星尾矩增大。这些结果表明RPA2通过调控DNA损伤修复参与PARPi耐药。

【TTK通过RPA2/ATR通路调控耐药】
研究发现TTK通过RPA2-S33磷酸化激活ATR信号通路。RPA2敲降或S33A突变均降低了ATR磷酸化水平。在TTK过表达细胞中，RPA2沉默或ATR抑制剂VE-821处理可部分逆转奥拉帕尼耐药。裸鼠实验证实，TTK抑制剂联合奥拉帕尼显著抑制肿瘤生长，并降低pRPA2(S33)和pATR水平。

这项研究系统阐明了TTK-RPA2-ATR轴在PARP抑制剂耐药中的关键作用：在HR功能正常的卵巢癌细胞中，TTK抑制剂通过抑制RPA2-S33磷酸化和ATR信号通路，有效克服奥拉帕尼耐药；而在HR缺陷细胞中，TTK过表达则通过增强DNA损伤修复能力促进耐药。这一发现不仅揭示了PARPi耐药的新机制，更为临床联合用药提供了重要理论依据。研究提出的TTK抑制剂与PARP抑制剂联用策略，有望为卵巢癌患者带来新的治疗选择，特别是对于产生获得性耐药的患者群体具有重要意义。