大蜡螟丝氨酸蛋白酶抑制剂Dipetalogastin-like蛋白的免疫调控机制及其抗菌特性研究

本研究针对昆虫免疫防御机制中的关键分子展开探索，研究人员通过分离鉴定大蜡螟(Galleria mellonella)血淋巴中的新型丝氨酸蛋白酶抑制剂GmSPID，揭示了其在应对昆虫病原菌Pseudomonas entomophila感染时的双重功能：既能显著抑制胰蛋白酶活性（60%抑制率/1.25μM），又对多种病原体（包括P. entomophila、B. thuringiensis等）展现广谱抗菌活性（7μM浓度下CFU减少60%）。该发现为昆虫先天免疫机制提供了新见解，并为开发新型抗感染药物提供了候选分子。研究运用RP-HPLC纯化、原子力显微镜等技术，首次阐明GmSPID通过破坏细菌膜完整性（膜穿孔率9%）发挥作用的分子机制。

　　

在昆虫与病原体长达数亿年的军备竞赛中，大蜡螟(Galleria mellonella)作为重要的模式生物，其免疫系统进化出了精妙的防御策略。尽管已知其血淋巴中含有20多种抗菌肽(AMPs)，但面对不断演化的病原体蛋白酶武器——如Pseudomonas entomophila分泌的碱性金属蛋白酶AprA和丝氨酸蛋白酶PspB，昆虫亟需更复杂的防御网络。这一科学问题激发了玛丽亚·居里-斯科洛多夫大学生物科学研究所免疫生物学系团队的研究兴趣，他们发现一种具有双重功能的免疫效应分子，相关成果发表在《Scientific Reports》上。

研究团队采用多学科技术手段：通过RP-HPLC分离免疫激活幼虫的血淋巴蛋白，结合Edman降解和质谱鉴定目标蛋白；运用qPCR检测脂肪体基因表达；采用酶活性抑制实验分析蛋白酶抑制特性；通过菌落计数评估抗菌谱；最后借助原子力显微镜(AFM)、扫描电镜(SEM)和透射电镜(TEM)三维解析抗菌机制。

GmSPID蛋白水平与昆虫免疫状态相关
比较RP-HPLC分离图谱时，25号组分在经口感染10³ CFU P. entomophila或血腔注射10-50 CFU的幼虫中显著增加。质谱鉴定该25 kDa蛋白为含四个Kazal结构域的丝氨酸蛋白酶抑制剂dipetalogastin-like（GmSPID）。基因表达分析显示，口服感染后脂肪体LOC113516003基因表达上调30-130倍，呈现剂量依赖性。

纯化蛋白的生物学活性
三步层析纯化的GmSPID对胰蛋白酶抑制最强（2.5μM浓度抑制83%活性），对弹性蛋白酶抑制较弱，对金属蛋白酶thermolysin无作用。抗菌实验显示其对P. entomophila、B. thuringiensis、P. aeruginosa等具有显著抑制效果（15μM时CFU减少80%），但对S. aureus无效。β-半乳糖苷酶渗漏实验证实其引起9%膜穿孔。

GmSPID诱导的细菌结构变化
AFM显示处理组细菌表面粗糙度增加2倍，粘附力增强3倍。SEM观察到细胞表面出现凹陷和突起，TEM则揭示处理组细菌出现膜结构破坏、胞质电子密度降低等超微结构改变，证实GmSPID通过破坏膜完整性发挥作用。

这项研究首次阐明GmSPID作为免疫调节分子的双重功能：通过Kazal结构域抑制病原体蛋白酶，同时通过β-折叠构象破坏细菌膜结构。这种"一石二鸟"的防御策略，不仅丰富了对昆虫Toll/Imd通路下游效应分子的认知，其独特的抗菌机制（温和膜穿孔而非完全裂解）更为设计新型抗感染药物提供了思路。特别值得注意的是，GmSPID对临床重要病原体P. aeruginosa和C. albicans的抑制活性，显示出跨物种应用的潜在价值。Jakub Kordaczuk等研究者通过多尺度技术联用，为理解宿主-病原体互作提供了新的分子视角。