棉茄土壤源肠球菌和施氏假单胞菌产纤维素酶的响应面优化及其在生物抛光中的应用

本研究针对化石燃料枯竭及环境污染问题，从棉田和茄田土壤中筛选出两株中温纤维素降解菌——粪肠球菌(Enterococcus faecium BS5)和施氏假单胞菌(Stutzerimonas stutzeri CS7)，首次报道了施氏假单胞菌的中温纤维素酶特性。通过单因素实验和响应面法(RSM)优化，使BS5和CS7的CMCase(羧甲基纤维素酶)产量分别提升2.43倍(20.4 U/mL)和2.18倍(24.08 U/mL)。酶学特性分析显示其最适温度40-45℃、pH 5.0-7.0，在棉织物生物抛光中实现2.06-2.20%的减重率，为同步糖化发酵(SSF)和纺织工业提供了高效环保的生物催化剂。

　　

在全球能源危机与环境污染的双重压力下，寻找可再生的化石燃料替代品成为当务之急。据统计，2023年全球化石燃料消耗量已达140,230.67 TWh，而剩余石油和煤炭储量仅能维持有限年限。更严峻的是，这些能源的燃烧会释放大量温室气体，加剧气候变化。在此背景下，以木质纤维素生物质为原料生产生物燃料的技术备受关注——这类资源不仅储量丰富（占植物干重的35-50%），还能有效解决农业废弃物焚烧带来的污染问题。然而，将纤维素转化为可发酵糖的关键在于高效纤维素酶的应用，传统真菌源纤维素酶存在发酵工艺复杂、耐温性差等缺陷，而细菌纤维素酶因其生长快速、耐极端环境和遗传操作便捷等优势，成为更具潜力的替代选择。

为解决上述问题，帕尔大学生命科学系的Mohammedfaizan Shaikh等研究人员从印度古吉拉特邦棉田(Gossypium arboretum)和茄田(Solanum melongena)土壤中分离出13株细菌，通过刚果红染色筛选出水解圈直径比(D/d)达3.06的粪肠球菌BS5和2.41的施氏假单胞菌CS7。值得注意的是，这是首次报道施氏假单胞菌具有中温纤维素酶活性。研究人员采用单因素实验(OFAT)和中心复合设计(RSM-CCD)对培养条件进行优化，发现BS5在pH 5.0、41℃、1.25%接种量、56小时条件下CMCase产量最高；CS7则在pH 7.0、43℃、2%接种量、42小时达到峰值。通过3D响应面分析揭示温度与pH的交互作用对酶活影响最为显著，最终使两菌株的CMCase产量分别提升至20.4 U/mL和24.08 U/mL，较初始水平提高2倍以上。

关键技术方法
研究采用CMC-BH培养基从土壤中分离纤维素降解菌，通过刚果红染色定量水解圈筛选高效菌株；利用16S rRNA测序结合生化鉴定（MR-VP试验、氧化酶测试等）确定菌种；通过DNS法测定CMCase活性，pNPG法检测β-葡萄糖苷酶活性；采用RSM-CCD设计四因素三水平实验优化产酶条件；最后通过棉织物重量损失率和还原糖释放量评估生物抛光效果。

研究结果

1. 菌株筛选与鉴定
从棉茄土壤分离的13株菌中，BS5和CS7表现出最强的CMC水解活性（初始酶活8.23 U/mL和11.05 U/mL）。BS5为革兰阳性球菌，尿素酶阴性；CS7为革兰阴性短杆菌，氧化酶阳性。16S rRNA分析显示二者分别与E. faecium(OR354911)和S. stutzeri(OR915422)相似度达99.39%和100%。

2. 产酶条件优化
单因素实验表明BS5在40℃、pH 5.0时生长和产酶最佳，CS7则偏好45℃、pH 7.0。RSM分析发现温度与pH对BS5酶活影响极显著(p<0.01)，而CS7的酶活主要受pH和孵育时间调控。二次回归模型R²均>0.94，验证实验误差<5%。

3. 酶学特性分析
粗酶液在40-45℃、pH 5.0-7.0范围内活性最高，20分钟即达反应平衡。底物特异性测试显示对CMC水解能力最强，其次是pNPG（β-葡萄糖苷酶活性5.49-6.17 U/mL），对木聚糖和果胶几乎无作用。

4. 生物抛光应用
棉织物经BS5和CS7粗酶处理24小时后，重量分别减少2.20%和2.06%，显著高于对照组(0.54%)，反应液中检测到1.62-1.67 μmol/mL还原糖，证实酶解作用。

结论与意义
该研究首次报道了施氏假单胞菌的中温纤维素酶特性，通过RSM优化使酶产量达到工业应用水平。其最适温度(40-45℃)与酵母发酵温度匹配，适用于同步糖化发酵(SSF)工艺简化生物燃料生产流程；酸性CMCase(pH 5.0)能满足纺织工业生物抛光对减少化学处理的环保需求。此外，菌株的多底物降解能力（含β-葡萄糖苷酶）可提升木质纤维素转化效率。这些发现为开发低成本、高效率的纤维素降解体系提供了新思路，相关技术已具备在造纸、饲料等行业的转化潜力。