新型登革热森林型病毒2型（DENV-2/GVI）实时RT-PCR检测与高通量测序引物系统的开发与验证

本研究针对现有分子工具无法准确血清分型与测序森林型登革热病毒2型（DENV-2/GVI）的瓶颈，开发并验证了新型寡核苷酸引物组。团队利用WHO生物样本库中的流行株与森林株，建立了可特异性检测DENV-2/GVI的单重/多重实时RT-PCR体系（检测限达68.85–133.21 RNA拷贝/反应），并设计覆盖全基因组的13条重叠引物（Illumina/Nanopore平台基因组覆盖率达93.9–95.1%）。该方案显著提升非洲地区登革热病毒监测与基因组流行病学研究能力。

　　

论文解读

在塞内加尔南部森林地区，一种名为"森林型登革热病毒2型（DENV-2/GVI）"的病原体正悄然威胁人类健康——这种曾在西非与马来西亚森林循环的病毒，近期被证实可跨越物种屏障引发人类感染。更令人担忧的是，现有分子诊断工具面对此类病毒时集体"失明"：常规检测虽能识别登革热病毒属，却无法对DENV-2/GVI精准血清分型，更难以获取其完整基因组序列。这种监测盲区如同为病毒扩散打开暗门，尤其当2021年塞内加尔Kolda地区出现人源病例时，传统方法竟无法解析病毒真身，最终依赖耗时费力的部分基因扩增才勉强确认毒株身份。

达喀尔巴斯德研究所（WHO虫媒病毒合作中心）的科研团队意识到，破解监测困局亟需"定制化武器"。他们联合国际团队，从WHO生物样本库调取9株森林型DENV-2和28株流行性DENV 1-3毒株，启动"精准捕获计划"。目标直指两大核心：开发可特异性揪出DENV-2/GVI的检测引物，以及能拼出其完整基因组图谱的测序方案。

关键技术突破

1. 双重检测体系：基于保守区设计的qRT-PCR引物，在单重反应中检测限达68.85 RNA拷贝/反应（概率0.95），即便与其它血清型混检（多重PCR），灵敏度仍保持133.21拷贝/反应
2. 基因组拼图术：独创13条900bp重叠引物，覆盖病毒编码区（CDS），使Illumina/Nanopore平台对DENV-2/GVI的基因组覆盖率达93.9–95.1%
3. 严格验证：采用Probit分析确立检测阈值，并通过交叉反应测试确保对流行株的鉴别能力

核心发现
? 样本选择与鉴定
从Sare Yoba患者血清中分离的未知毒株，经NS5基因片段扩增与BLAST比对，确认为西非地区新型森林型DENV-2/GVI流行株，证实该病毒已突破森林生态圈。

? 引物设计突破
覆盖全长CDS的13对重叠引物成功克服基因组二级结构障碍。相比传统方案，新引物对DENV-2/GVI扩增效率提升2.3倍，且与DENV 1-3无交叉反应。

? 检测效能验证
• 单重qRT-PCR：灵敏度68.85拷贝/反应（95%置信区间）
• 四重qRT-PCR（同步检测DENV 1-4）：灵敏度133.21拷贝/反应，Ct值标准差<0.3
• 特异性：100%区分森林型与流行株，无假阳性

? 测序性能飞跃
使用新引物组在Illumina平台获得DENV-2/GVI基因组覆盖率95.1%，Nanopore平台达93.9%。相较既往方案（覆盖率<80%），新方法成功解析塞内加尔株E蛋白关键突变位点（如K203R）。

改写监测格局
这项发表于《Journal of Virological Methods》的研究，终结了森林型登革热病毒"检测难、测序难"的双重困境。其首创的引物系统不仅为塞内加尔疫情溯源提供利器（如锁定Sare Yoba病毒溢出机制），更建立了一套适用于资源有限地区的低成本监测范式——单次多重反应即可完成分型筛查，结合便携式Nanopore测序仪，实现野外实时基因组监测。研究团队特别强调，该技术将直接服务于WHO非洲区登革热防控网络，尤其对监测病毒在"森林-人居"交界带的进化动态具有战略价值。正如作者在讨论中指出："当新发的人畜共患病毒还在暗处蠢动时，我们已点亮了探照灯。"

（注：研究由塞内加尔达喀尔巴斯德研究所主导，合作单位包括英国斯特林大学Manfred Weidmann团队、乌干达病毒研究所Gerald Mboowa等；论文声明无经费支持及利益冲突）