微管结合诱导驱动蛋白-1形成Mg2+缺失的类无核苷酸ADP预释放构象，其自抑制尾部无影响

本研究针对驱动蛋白-1（kinesin-1）在微管（MT）结合后ADP释放的分子机制争议，通过设计嵌合体Kif5bMoNeIAK/Kif5bMoNeXXX，结合冷冻电镜（cryo-EM）和分子动力学模拟（MD），首次解析了MT结合状态下Mg2+-ADP复合物丢失Mg2+后形成的类无核苷酸（apo-like）构象。研究发现MT结合重塑核苷酸结合位点氢键网络，触发Mg2+解离（ADP释放限速步骤），且自抑制尾部（含IAK基序）即使介导马达域"拉链式"二聚化，也不影响该构象转变或颈链接器解耦。该成果修正了"双锁抑制"模型，为解释驱动蛋白-1在MT上的特征性暂停行为提供新机制，发表于《Nature Communications》。

　　

论文解读

研究背景：分子马达的精准调控之谜

细胞内物质运输依赖驱动蛋白超家族分子马达，其中驱动蛋白-1（kinesin-1）作为典型的二聚体马达，通过ATP水解沿微管（MT）向正极（⁺-end）进行过程性运动，运输线粒体、囊泡等关键货物。为节省能量，无货物时驱动蛋白-1通过其C端尾部（tail）与N端马达域结合形成自抑制构象，大幅降低ATP酶活性。这一自抑制的核心在于尾部IAK（异亮氨酸-丙氨酸-赖氨酸）基序与马达域的相互作用，但其分子机制长期存在争议：早期研究认为IAK直接阻断ADP释放的核苷酸口袋，而后续晶体结构则提出"拉链式"二聚化通过限制颈链接器（neck linker）构象间接抑制功能（"双锁抑制"模型）。此外，MT结合如何将ADP释放速率提高10⁴倍仍是未解之谜，尤其是限速步骤Mg²⁺-ADP解离的构象变化细节尚未在原子层面阐明。

研究设计与技术方法

为厘清上述问题，伦敦国王学院、意大利技术研究院等机构的研究团队设计两种"盆景式"（bonsai）嵌合体：Kif5bMoNeIAK（融合IAK基序）与Kif5bMoNeXXX（IAK突变体），结合冷冻电镜解析MT结合状态（分辨率2.8–3.4 ?），辅以分子动力学模拟（累计9.75 μs）和MT共沉降实验验证。样本来源于猪脑微管蛋白，研究聚焦于ADP与ATP类似物AMPPNP结合状态下的构象差异。

研究结果与发现

1. 嵌合体设计验证自抑制尾部介导二聚化

   • Kif5bMoNeIAK通过IAK基序形成二聚体（图1d），而Kif5bMoNeXXX仅为单体，证实IAK是自抑制构象的关键介导者。
     
     

2. 冷冻电镜捕获尾部结合的双态构象

   • MT结合时，Kif5bMoNeIAK存在单头吸附与"拉链式"双头结合两种状态（图1e-h），其中双头态在AMPPNP中占比更高（47% vs ADP的26%）。尾部结合于环6（L6）和环8（L8）间的裂隙，与MT结合状态无关。
     
     

3. MT结合诱导Mg²⁺缺失的类apo构象

   • 关键突破：Kif5bMoNeXXX-ADP结构显示，MT结合后核苷酸口袋存在ADP但无Mg²⁺密度（图2c），同时环9（含switch I基序）部分解旋、环11（含switch II基序）形成螺旋转角，整体构象更接近无核苷酸（apo）状态（图2g）。
     
     

4. MT触发Mg²⁺解离的两步机制

   • 构象分析揭示：MT结合延伸α4螺旋并扭转核心β-折叠，破坏β7的D231与α2a的T92间氢键网络（原协调Mg²⁺），驱动Mg²⁺解离（步骤1）；随后D231与环9的R190及α2a的K91形成新氢键网络，