基于表面等离子体共振的集成检测技术：实现粗样本中单克隆抗体的定量与糖基化表征

这篇综述创新性地开发了一种基于表面等离子体共振（SPR）的集成检测方法，可在粗样本中同步实现单克隆抗体（mAbs）的定量和糖基化表征（如核心岩藻糖和末端半乳糖）。该方法通过蛋白A（Protein A）捕获抗体并利用FcγRII受体动力学分析，无需样本纯化即可完成生物反应器细胞培养的在线监测（at-line），为生物制药行业提供了一种符合质量源于设计（QbD）和过程分析技术（PAT）的高效工具。

　　

引言

近年来，癌症、自身免疫性疾病和传染病的激增推动单克隆抗体（mAbs）成为生物治疗的主力军。作为关键质量属性（CQA），抗体的糖基化状态直接影响其疗效和安全性，尤其是Fc区N297位点的糖链修饰。传统的高效液相色谱（HPLC）和质谱（MS）技术虽能全面分析糖型，但步骤繁琐且难以实时监测。本研究提出了一种基于表面等离子体共振（SPR）的集成检测策略，将抗体定量与糖基化表征合二为一，为生物制药过程控制提供了新思路。

方法论

样本制备与糖型分析
通过CHO^55E1细胞瞬时表达系统制备了三种曲妥珠单抗（TZM）变体：野生型（TZM-WT）、高半乳糖化型（TZM-GT）和无岩藻糖型（TZM-AF），并利用FUT8敲除细胞系确保TZM-AF的糖链纯度。利妥昔单抗（RTX）则通过诱导型CHO^BRI/rcTA细胞系生产，获得不同岩藻糖水平的四个批次。糖链分析采用亲水相互作用色谱-超高效液相色谱（HILIC-UPLC），通过2-氨基苯甲酰胺（2-AB）标记和葡萄糖单位（GU）校准，精确解析各糖型比例。

SPR检测设计
实验在5°C的Biacore T100系统上进行，以减缓动力学差异。首先通过胺偶联将蛋白A固定于CM5芯片表面（约4000 RU），形成“微型亲和色谱单元”。检测分三步：

1. 定量阶段：在质量传输限制（MTL）条件下注入粗样本，利用蛋白A与IgG Fc的特异性结合，通过信号斜率计算浓度（线性范围0.5-50 nM）；
2. 原位纯化：高流速缓冲液冲洗去除杂质；
3. 糖型表征：注入FcγRIIA/B（10-300 nM），通过解离相曲线下面积（AUC）量化半乳糖化（FcγRIIA响应）和岩藻糖化（FcγRIIB响应）。

结果与讨论

糖型解析与验证
HILIC-UPLC证实TZM-WT岩藻糖化率>90%，而TZM-GT半乳糖化率达68.3%。SPR检测显示，FcγRIIA与高半乳糖化IgG的解离更缓慢（AUC增加），而FcγRIIB对无岩藻糖IgG的亲和力显著降低。通过AUC建立的线性模型（R²>0.9）可准确预测粗样本中半乳糖化（误差±4.2%）和岩藻糖化（误差±6.5%）水平。

技术优势

1. 免纯化检测：蛋白A表面可高效去除培养基杂质，粗样本与纯化样本的K_D值无显著差异（如TZM-AF与FcγRIIB的K_D分别为180±10 nM和170±30 nM）；
2. 快速低耗：单次检测仅需12分钟，消耗0.87 μg抗体；
3. 温度调控：5°C操作显著放大不同糖型的动力学差异，而传统25°C条件难以区分。

应用前景
该技术可实时监测生物反应器中抗体的核心质量属性（如ADCC相关的岩藻糖缺失和CDC相关的半乳糖修饰），符合FDA质量源于设计（QbD）指南。未来或可拓展至其他IgG亚型及糖型（如唾液酸化）分析，推动生物制药的智能化生产。

结论

本研究开发的SPR集成检测法突破了传统糖分析技术的局限性，为单克隆抗体的在线质量监控提供了高效、特异的解决方案，有望成为生物制药过程分析技术（PAT）的关键工具。