中国仓鼠卵巢细胞无血清培养基适应与低温培养的转录组学解析及其在生物制药中的应用

这篇综述通过整合三个CHO细胞系的RNA-seq数据集，系统解析了无血清培养基（SFM）适应和低温培养（33°C）对细胞转录组的全局影响。研究发现胆固醇生物合成通路（SREBP途径）在SFM适应中起关键作用，而p53信号通路（Zmat3/Btg2介导）调控低温诱导的细胞周期停滞。研究创新性地鉴定了10个新型持家基因（HKG），为CHO细胞基因表达分析提供了更可靠的标准化参照。该研究为加速生物工艺开发提供了潜在分子靶点（如Insig1/Srebf2），对提高重组生物药（如抗IL-8单抗）产量和质量具有重要指导意义。

　　

中国仓鼠卵巢细胞（CHO）培养的转录组学突破

ABSTRACT
CHO细胞作为重组生物药生产的主力细胞，其产量低下导致市场价格居高不下。本研究整合三个CHO细胞系（rCHO DP-12、CHO dhFr-、CHO K1-PF）在四种工业相关处理条件下的RNA-seq数据，通过加权基因共表达网络分析（WGCNA），揭示了影响细胞适应性和产物质量的关键分子机制。

细胞生长与代谢特征
实验设计涵盖血清梯度适应（10%→0%）、温度（37°C→33°C）、pH（6.70/6.95）和葡萄糖（10/30 mM）处理。生长曲线显示，33°C培养显著降低两种细胞系的生长速率（p≤0.05），而pH和葡萄糖浓度影响微弱。代谢分析显示所有处理组在RNA提取时均处于指数生长期，乳酸积累处于非抑制水平。

转录组全局特征
主成分分析（PCA）显示细胞系差异贡献41%变异（PC1），血清适应贡献31%变异（PC2）。温度效应在两种细胞系中呈现相似变化模式，而葡萄糖和pH影响可忽略。差异表达基因（DEG）分析鉴定出2072个血清敏感基因和954个温度敏感基因，其中703个基因在外部数据集（GSE75094）中验证为血清适应关键基因。

无血清适应机制
GO分析显示细胞外基质（GO:0031012）和细胞粘附（GO:0007155）相关基因显著变化。最突出的发现是胆固醇（GO:0006695）和类固醇生物合成通路（mevalonate途径）在成功适应SFM的细胞中上调，该通路基因主要富集在绿松石模块。KEGG分析证实谷胱甘肽代谢在所有细胞系中上调，而PI3K-Akt信号通路仅在rCHO DP-12和外部CHO-K1中激活。

关键调控靶点
WGCNA鉴定出35个枢纽基因，包括胆固醇合成限速酶HMGCR和SQLE，以及调控因子HSD17B7。值得注意的是，硬脂酰-CoA去饱和酶2（Scd2）在预适应的CHO K1-PF中表达量最高（>300,000标准化计数）。SREBP通路核心调控元件Srebf2（编码SREBP2）和抑制因子Insig1虽未列为枢纽基因，但被发现连接多个关键节点。此前研究证实，过表达Srebf1/Scd1能通过扩大内质网（ER）提高重组蛋白产量，而抑制Insig1可增加胆固醇合成和高尔基体体积。

温度响应机制
33°C培养导致细胞周期（GO:0007059）和DNA复制（GO:0006260）相关基因下调。p53信号通路显著扰动，其靶基因Tp53inp1表达增加9倍。枢纽基因分析鉴定出p53效应因子Btg2（在CHO K1-PF中上调20倍）和Zmat3，前者通过抑制cyclin D1/E阻滞G1/S转换，后者调控MDM4/MDM2等p53抑制因子。这与既往报道的ATR–p53–p21通路激活机制一致。

重组产物表达
抗IL-8单抗的轻重链转录本分别位列rCHO DP-12表达量第12和第2位。血清浓度从10%降至5%时，两者表达显著增加（FDR≤0.01，|FC|≥1.5），但在温度处理中保持稳定。转染的dhfr基因在SFM适应过程中表达上调，可能与CHO dhFr-细胞（含dhfr基因缺陷）无法适应<5%血清相关。

糖基化调控
32个糖基化基因在血清适应中差异表达，其中唾液酸酶Neu2表达降低300倍，而唾液酸转移酶St3gal3/St6galnac6表达增加。温度处理显著影响9个糖基化基因，包括核苷酸糖转运体Slc35d1/d2（与半乳糖基化增加相关）和ER质量控制酶Uggt2。这些发现解释了文献中关于温度对糖基化影响不一致的报道。

新型持家基因
通过最大变异系数（MFC-CV）筛选，鉴定出10个表达稳定的新型持家基因（如Dynlt1b、Psmb2），其变异系数显著低于传统参照基因（如Gapdh、Actb）。这些基因编码蛋白功能多样且共调控程度低，适用于常规CHO细胞培养条件的表达标准化。

工程化启示
该研究提出通过调控SREBP通路（如过表达Srebf2或抑制Insig1）加速SFM适应，同时揭示了温度敏感枢纽基因（Btg2/Zmat3）作为细胞周期调控靶点的潜力。此外，糖基化相关基因（Neu2/Slc35d1）的发现为优化产物质量属性提供了新思路。这些发现为CHO细胞工程化和生物工艺优化提供了分子层面的理论依据。