单结构域双活性位点融合蛋白：肽催化与酶催化的协同创新策略

这篇研究开创性地将肽催化剂（PPE）与醇脱氢酶（ADH）整合到单一蛋白结构域中，构建了具有双活性位点的"生物-肽"杂合催化剂（PPE-ADH）。该体系成功实现了醇氧化与C─C键形成的级联反应（cascade catalysis），揭示了反应速率不匹配、赖氨酸（Lys）残基干扰等关键挑战，为多功能生物催化剂设计提供了新范式。

　　

1 引言
传统生物催化体系通常在每个结构域中仅含单一活性位点。本研究突破性地提出将三肽催化剂H-lPro-lPro-lGlu（PPE）与醇脱氢酶（ADH）融合，构建单结构域双活性位点催化剂。选择醇氧化/C─C键形成的级联反应作为模型体系，其中ADH催化醇氧化生成醛，PPE通过烯胺中间体介导醛与硝基烯烃的立体选择性加成。AlphaFold模型显示PPE三肽成功整合于嗜热脂肪地芽孢杆菌（G. stearothermophilus）四聚体ADH的N端。

2 结果与讨论
通过蛋白质工程构建的PPE-ADH杂合体在单独测试中显示：ADH活性比野生型提高30%，而C─C键形成活性与游离PPE相当（产率51% vs 92%），但立体选择性较低（9% ee vs 15% ee）。研究发现ADH骨架中的29个赖氨酸残基通过ε-氨基参与背景反应，导致外消旋产物形成。通过pK_a计算指导的定点突变发现：替换8个关键Lys残基（Ala/Asn突变体）可降低背景反应，但会完全丧失ADH活性。有趣的是，将N端Pro替换为His（HPE-ADH）可反转立体选择性（5% ee, S,R构型），表明N端α-氨基参与催化。

级联反应优化显示：乳酸脱氢酶（LDH）/丙酮酸（Pyr）是最佳NAD⁺再生系统，36小时内实现36%的级联产率。动力学监测揭示反应速率不匹配——10分钟内37%的醇被氧化，但1小时后仅4%的C─C键产物形成。底物拓展实验证实该体系对富电子硝基烯烃（3b-f）的普适性，且立体选择性与游离PPE相当。值得注意的是，当使用含三个立体中心的硝基烯烃3g时，仍获得36%产率。

3 结论
该研究首次在单蛋白结构域中实现肽催化与酶催化的融合，为级联反应提供了新工具。研究揭示三大关键挑战：反应速率匹配、活性位点干扰（特别是Lys残基）、以及水相环境对肽催化剂立体选择性的负面影响。尽管当前体系效率有限，但通过合理设计疏水微环境、优化肽段定位等策略，这类"双位点"催化剂有望拓展生物催化与有机催化的协同应用边界。这项工作为开发新型多功能生物催化剂奠定了基础，特别适用于需要同时构建碳骨架和官能团转化的复杂合成路线。