胃食管组织单细胞RNA测序、类器官培养与RNA-蛋白空间分析的整合方案开发及其在发育与疾病研究中的应用

本研究针对胃食管连接部(GEJ)发育与疾病机制不清的问题，开发了整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)、3D类器官培养和空间RNA-蛋白分析的技术方案。通过优化组织解离方法，成功解析了小鼠胚胎至成年期GEJ的细胞异质性，发现WNT信号通路在胃/食管类器官培养中的差异化需求，为Barrett食管(BE)等疾病研究提供了重要工具。论文发表于《BMC Methods》。

　　

胃食管连接部(GEJ)作为食管与胃的过渡区域，其独特的组织结构和细胞组成在消化系统中扮演着关键角色。这个区域的异常变化与多种疾病密切相关，包括胃食管反流病(GERD)、Barrett食管(BE)甚至癌症。然而，由于GEJ复杂的细胞组成和动态的发育过程，科学家们对其发育机制和疾病发生过程的理解仍存在重大空白。更棘手的是，现有研究模型难以同时捕捉细胞异质性、空间位置信息和动态发育过程，这严重限制了相关疾病的机制研究和治疗开发。

针对这些挑战，来自德国研究团队在《BMC Methods》发表了一项突破性研究。他们开发了一套整合单细胞RNA测序(scRNA-seq)、三维类器官培养和空间分子分析的技术方案，首次系统解析了小鼠从胚胎期到成年期GEJ的发育动态，并成功建立了能模拟体内特征的胃食管类器官模型。这项研究不仅揭示了GEJ发育过程中的关键信号通路调控机制，更为相关疾病研究提供了强有力的工具平台。

关键技术方法包括：1) 优化胚胎/成年小鼠GEJ组织解离方案，采用TrypLE(胚胎)和胶原酶II/TrypLE(成年)组合获得高活性单细胞；2) 建立无WNT的食管类器官和WNT依赖的胃类器官培养体系；3) 结合RNAscope和免疫荧光实现RNA-蛋白共定位分析。研究使用C57BL/6小鼠的胚胎(E15/E19)、新生和成年(8周)GEJ组织作为样本来源。

单细胞RNA测序揭示发育动态
通过优化组织解离方案，研究人员成功获取了胚胎和成年GEJ的高质量单细胞悬液。scRNA-seq分析鉴定出平滑肌细胞、多种基质细胞亚型(Stroma-1至Stroma-4)、鳞状上皮、免疫细胞、内皮细胞、神经细胞和柱状上皮等主要细胞群体。

关键发育调控因子表达模式
研究发现转录因子GATA6和SOX2在胃和食管上皮中呈现互补表达模式：GATA6主要表达于柱状上皮(胃)，而SOX2特异性表达于鳞状上皮(食管)。这种分化特征在胚胎期(E15/E19)就已确立，并通过免疫荧光在组织切片中得到验证。

类器官培养体系的突破
研究建立了两种不同的类器官培养条件：胃类器官需要WNT3A和R-spondin1条件培养基(WR+)，而食管类器官在无WNT条件下生长更好。这种差异反映了体内微环境的不同：胃柱状干细胞存在于WNT丰富的微环境中(Lgr5⁺/Axin2⁺)，而食管上皮处于WNT抑制环境(基质细胞表达Dkk2/Sfrp4)。

空间分子图谱验证
通过单分子RNA原位杂交(smRNA-ISH)结合免疫荧光，研究在组织原位验证了Sfrp4(一种WNT通路抑制剂)在食管基质细胞中的特异性表达，与上皮标记物CDH1和平滑肌标记物ACTA2共定位，证实了scRNA-seq发现的细胞互作网络。

这项研究通过整合多组学技术，首次系统描绘了GEJ发育过程中的细胞和分子动态变化。其建立的优化方案解决了长期以来胃食管组织单细胞分离困难、类器官培养条件不明确等技术瓶颈。特别是发现WNT信号通路在胃/食管上皮维持中的差异化作用，为理解Barrett食管(BE)的发病机制(鳞状上皮向柱状上皮的化生)提供了重要线索。

技术层面，该研究提出的smRNA-ISH与免疫荧光共染方案，在抗体受限的情况下实现了RNA和蛋白的同步检测，为空间多组学研究提供了实用方法。类器官培养体系的优化则使长期维持患者来源的胃食管组织成为可能，为个性化医疗和药物筛选奠定了基础。

尽管存在缺乏血管化和机械力模拟等局限性，这套整合方案仍将成为研究GEJ发育生物学和疾病机制的重要工具。未来，结合患者样本和类器官模型，该技术平台有望加速GERD、BE及相关癌症的转化研究，为开发靶向治疗策略提供新思路。