UMPlexTM靶向测序引物设计工作流程：提升流感样患者病原体检测效率的创新方案

为解决流感样疾病病原体检测覆盖率不足的问题，深圳疾控中心团队开发了UMPlexTM靶向测序(tNGS)引物设计系统。该研究通过多基因组保守区域分析和迭代验证，构建了覆盖125种呼吸道病原体的检测体系，临床验证显示其灵敏度达4 CFU/mL，较TaqMan Array多检出14种病原体，与宏基因组测序(mNGS)结果一致性达87.8%，为流感监测提供了高效精准的新工具。

　　

每年全球因季节性流感导致的呼吸道相关死亡高达29-65万例，但传统检测方法面临严峻挑战：qPCR需多次检测才能确认共感染，商业多重检测试剂盒（如TaqMan Array）对罕见病原体和耐药基因覆盖不足，而宏基因组测序(mNGS)又因人类核酸干扰导致成本高昂。更棘手的是，超过50%的流感样病例无法通过现有技术明确病原体，这严重影响了精准诊疗和疫情控制。

针对这一难题，深圳市疾病预防控制中心联合海南医科大学的研究团队在《Virology Journal》发表了一项突破性研究。他们开发的UMPlex^TM工作流程，通过生物信息学筛选和实验验证相结合的方式，建立了覆盖125种呼吸道病原体的靶向测序(tNGS)系统。研究团队从NCBI数据库选取330个基因片段，使用Primer3软件设计引物，通过电子PCR评估覆盖率和特异性，最终构建了包含病毒、细菌、真菌和耐药基因的检测体系。临床验证采用107份流感阳性样本和50份对照样本，通过平行比较TaqMan Array和mNGS的性能，证实了新系统的优越性。

关键技术方法
研究采用三步走策略：首先基于中国流行株基因组设计引物库，允许3'端五碱基内零错配；其次用PATRIC数据库评估扩增均一性，每个病原体设计≥2对引物应对突变；最后通过质粒混合实验和临床样本（含肺泡灌洗液）验证灵敏度。核酸提取使用Qiagen RNeasy试剂盒，数据分析采用ggseqlogo包进行序列标识可视化。

研究结果
引物设计与验证流程
通过保守序列设计的引物经生物信息学过滤后，合成质粒验证显示扩增效率差异控制在0.2-5倍范围内。对流感A病毒M基因的分析发现，尽管38,433条基因组序列存在靶点突变，但NP蛋白引物仍保持100%覆盖率，证实多靶点设计的必要性。

生物信息学评估结果
最终引物对流感A和金黄色葡萄球菌(S. aureus)的数据库覆盖率达100%，特异性达99.5%。其中PC-13引物在32,604条流感序列中仅1例假阳性，PC-2引物在49,975条序列中零交叉反应。

扩增均一性评估
质粒混合实验显示，12轮扩增后各靶点读数比差异<5倍。临床样本验证发现，无症状对照组的病原体读数显著低于流感样患者组，证实系统特异性。

临床样本验证
在107份样本中，tNGS不仅检出TaqMan Array遗漏的鼻病毒（经Sanger测序确认），还多检出25例细菌感染。值得注意的是，C反应蛋白(CRP)升高患者中细菌检出量是正常者的3倍，提示该系统对细菌共感染的预警价值。与mNGS相比，tNGS在49例肺炎患者中检出6例白色念珠菌(C. albicans)而mNGS仅检出5例，且数据量减少90%。

讨论与意义
该研究创新性地通过"冗余引物"策略解决了病原体突变导致的检测失效问题。例如针对流感A病毒，同时靶向NP和M蛋白的设计确保即使M基因发生突变（如WHO警告的灵敏度下降问题），仍能通过NP靶点实现可靠检测。在公共卫生应用层面，系统首次实现了对流感样患者中HHV-7病毒和鲍曼不动杆菌(A. baumannii)共感染的规律性发现，为抗生素使用决策提供了新依据。

技术层面，UMPlex^TM将tNGS的灵敏度推进至4 CFU/mL，远超qPCR的64 CFU/mL检测限。虽然平台目前仅支持有限并发用户，但研究者已公开设计流程（http://183.11.230.224:8043/），为个性化tNGS系统开发提供了范本。这项研究不仅革新了流感监测网络的技术基础，更开创了"症状导向型"病原体检测新模式，为应对未来新发传染病疫情储备了关键技术。