基于宏基因组学的百合新型花椰菜花叶病毒科病毒发现及其分子标记开发研究

本研究针对百合产业中病毒变异多样性和新病原体出现导致的严重经济损失问题，通过整合宏基因组测序和Sanger测序技术，首次在卷丹百合(Lilium lancifolium Thunb.)中发现两种新型花椰菜花叶病毒科(Caulimoviridae)病毒LCaA和LCaB，并开发出四组特异性PCR分子标记。该研究为百合病毒早期检测和防控提供了重要技术支撑，相关成果发表于《Virology Journal》。

　　

百合作为重要的食用和药用资源，其产业健康发展正面临严峻挑战。病毒通过鳞茎繁殖广泛传播，导致产量和品质下降，全球已报道近19种侵染百合的病毒，其中百合无症状病毒(LSV)、百合斑驳病毒(LMoV)和黄瓜花叶病毒(CMV)构成主要的三重病毒复合体，在中国多个百合主产区造成重大经济损失。传统检测方法如ELISA和RT-PCR仅适用于已知病毒，对新型病毒检测能力有限。宏基因组测序技术的出现为全面解析植物病毒组提供了新机遇，但目前环境样本中病毒多样性探测率不足1%，大量未知病毒亟待发现。

武汉市农业科学院等机构的研究团队通过整合宏基因组学和分子生物学技术，在卷丹百合中发现两种新型花椰菜花叶病毒科病毒Lancifolium Caulimovirus A(LCaA)和Lancifolium Caulimovirus B(LCaB)，并开发出特异性分子标记体系。该研究为百合病毒病防控提供了新工具，相关成果发表在《Virology Journal》。

研究采用宏基因组测序结合Sanger测序验证的技术路线。从武汉新洲区、江夏区及恩施市三个海拔区域采集表现叶绿素缺失和坏死病征的百合样本，使用CTAB法提取总DNA。通过DNBSEQ-T7平台进行150 bp双端测序，获得38 GB高质量数据。利用SPAdes软件进行de novo组装，经DeepVirfinder等工具预测病毒序列。基于基因组变异特征设计特异性引物，通过PCR扩增和电泳分析建立检测体系。

DNA viruses in the detected samples

研究通过宏基因组测序发现两个具有花椰菜花叶病毒科特征的contig序列tig000081(7,546 nt)和tig000315(7,585 nt)，分别命名为LCaA和LCaB。通过分段克隆验证获得完整基因组序列，LCaA全长7,542 nt，含4个ORF，分别编码移动蛋白(MP)、外壳蛋白、复制成熟多蛋白(含RT POL和RNase HI RT Ty3结构域)及功能未知蛋白；LCaB全长7,582 nt，含3个ORF，编码移动蛋白、多功能蛋白(含逆转录酶结构域)和跨膜蛋白。

The genetic evolutionary relationship of the genus Caulimovirus

系统进化分析显示LCaA和LCaB与草莓脉带病毒(SVBV)、锦葵黄花叶病毒(MYMAV)等聚为一支，形成独立进化分支。18个已鉴定的花椰菜花叶病毒属成员可分为4个明显分支，LCa病毒与植物相关花椰菜花叶病毒(PAC)亲缘关系最近。

Marker-based identification of LCa DNA viruses

基于7个LCaA和6个LCaB分离株(基因组相似性分别为99.59-99.73%和98.51-98.91%)的序列变异，开发出四组分子标记。Marker 1和2可同时检测LCaA(519 bp)和LCaB(513 bp)，Marker 3(342 bp)和4(203 bp)分别特异性识别LCaA和LCaB。应用该体系发现双河镇样本中LCa病毒检出率达10%。

Viral abundance analysis of all detected viruses

病毒丰度分析显示，Sobelivirales目(8%)、鸢尾马铃薯Y病毒(Iris potyvirus A，5%)和葱黄条病毒(Shallot yellow stripe virus，4%)为主要RNA病毒，而DNA病毒中花椰菜花叶病毒科仅占0.001%。

该研究首次报道了百合中两种新型花椰菜花叶病毒科病毒的发现和鉴定，建立的分子标记体系具有快速、特异、经济等优势，为百合病毒早期诊断和防控提供了重要技术手段。发现的LCa病毒可能引起叶绿素缺失和鳞茎腐烂症状，其进化地位和致病机制仍需深入研究。宏基因组技术的应用为植物病毒组研究提供了新范式，未来通过提高测序深度可进一步提升病毒发现效率。