黄瓜叶内生黑曲霉提取物的抗菌、抗生物膜及促伤口愈合作用：体外与体内研究揭示其多重治疗潜力

本研究针对耐药性金黄色葡萄球菌(S. aureus)感染和慢性伤口愈合难题，从黄瓜(Cucumis sativus)叶片中首次分离内生黑曲霉(Aspergillus niger)，通过LC-HRMS/MS鉴定其含15种吡喃酮和醌类活性成分（如尼日阿斯珀酮A、柠檬酸等）。研究发现该提取物(ANM)对临床S. aureus分离株表现出显著抗菌活性(MIC 32-512 μg/mL)，可减少生物膜形成（强生物膜产生菌从40%降至5%），并通过抑制TNF-α表达(降低28.6%)和促进成纤维细胞迁移（伤口闭合率99.68%）展现抗炎与促愈合作用。该成果为开发新型抗耐药菌感染和伤口修复疗法提供了天然候选物质。

　　

耐药菌感染和慢性伤口愈合是当前临床面临的重大挑战。耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)因其快速耐药性发展和生物膜保护机制，导致传统抗生素治疗效果受限。同时，伤口感染常伴随持续性炎症反应，延缓组织修复进程。面对这一双重难题，探索具有多重生物活性的天然产物成为研究热点。

坦塔大学的研究团队将目光投向植物内生真菌——这类与宿主共生却能独立产生丰富次级代谢产物的微生物。他们从埃及本土黄瓜叶片中成功分离出内生黑曲霉(Aspergillus niger)，通过18S rRNA测序确认其分类地位（基因登录号FJ981625.1）。研究人员采用亚洲大米固态培养获取真菌代谢产物，利用高分辨液质联用技术(LC-HRESI-MS/MS)解析出15种特征性化合物，包括尼日阿斯珀酮A(nigerasperone A)、柠檬酸(citric acid)等吡喃酮和醌类物质。

在抗菌实验中，该提取物(ANM)对20株临床S. aureus分离株表现出广谱抑制效果，最小抑菌浓度(MIC)范围为32-512 μg/mL。尤为重要的是，亚抑菌浓度(1/2 MIC)处理可使生物膜形成菌株从19株减少至6株，扫描电镜(SEM)显示细菌细胞长度缩短69%，且生物膜基质明显减少。在抗炎机制方面，ANM使脂多糖(LPS)刺激的WI38成纤维细胞中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)基因表达降低28.6%。伤口愈合实验显示，ANM处理组48小时伤口闭合率达99.68%，显著高于对照组(83.37%)。

动物实验进一步验证了其治疗潜力。在MRSA感染的大鼠伤口模型中，ANM(50 mg/kg)治疗组第6天伤口面积仅剩余6.35%，组织学显示完整表皮再生和皮肤附属器形成。相比之下，感染未治疗组仍存在表皮分离和炎症浸润。

主要技术方法
研究采用18S rRNA基因测序鉴定真菌；LC-HRMS/MS分析代谢产物；微量肉汤稀释法测定MIC；结晶紫染色法评估生物膜；qPCR检测TNF-α表达；划痕实验和动物伤口模型评价愈合效果。临床菌株来源于坦塔大学微生物学系保藏库。

研究结果

1. 内生真菌鉴定与化学表征
   通过形态学和分子鉴定确认菌株为黑曲霉，LC-HRMS/MS分析揭示其代谢物以吡喃酮和醌类为主，包括具有已知抗菌活性的尼日阿斯珀酮A和抗炎作用的柠檬酸。

2. 体外抗菌活性
   ANM对S. aureus ATCC 25923的抑菌圈直径达16.67±0.58 mm，接近庆大霉素(17.67 mm)。对临床分离株的MIC分布显示45%菌株对128 μg/mL敏感。

3. 抗生物膜作用
   1/2 MIC ANM处理使强生物膜产生菌比例从40%降至5%，SEM直观显示细菌形态扭曲和基质减少。

4. 抗炎与伤口愈合
   ANM(8.4 μg/mL)使LPS诱导的TNF-α表达从3.08倍降至2.2倍。划痕实验显示24小时愈合率提升2.8倍。

5. 体内伤口修复
   低剂量ANM组(50 mg/kg)愈合效果最优，第6天组织学可见完整毛囊和皮脂腺结构，而阳性对照(庆大霉素)组仍存在表皮空泡化。

结论与意义
该研究首次系统报道了黄瓜来源内生黑曲霉的多重生物活性。其代谢产物通过协同作用破坏细菌膜结构（酚类）、干扰DNA复制（聚酮化合物）和螯合金属离子（有机酸），实现对耐药菌的广谱抑制。同时，通过下调TNF-α等促炎因子和促进成纤维细胞迁移，创造有利于组织再生的微环境。这种"抗菌-抗炎-促修复"三位一体的作用机制，为开发兼具抗感染和促愈合功能的复合型伤口治疗剂提供了新思路。研究结果发表于《BMC Microbiology》，后续研究可聚焦于单体化合物分离和临床前安全性评价。