单次高剂量辐射诱导肺腺癌细胞系蛋白质组变化揭示EPHA2与CTSD作为潜在治疗靶点

本研究针对非小细胞肺癌(NSCLC)治疗中放射疗法与靶向治疗的协同机制这一未解难题，通过蛋白质组学技术系统分析了10 Gy高剂量辐射对HCC-44和A549肺腺癌细胞系（包括3D球体培养模型）的分子影响。研究发现辐射显著上调EPHA2、IGF2R、TSPAN3和CTSD等膜相关蛋白表达，并通过抑制剂实验证实EPHA2和CTSD可作为增强放疗敏感性的新靶点，为开发抗体药物偶联物(ADC)联合立体定向放疗的精准治疗方案提供了重要分子依据。

　　

肺癌作为全球癌症相关死亡的首要原因，其中非小细胞肺癌(NSCLC)占比高达85%。尽管立体定向放射治疗等新技术的应用改善了患者预后，但关于放疗与靶向治疗协同作用的分子机制仍存在巨大知识空白。特别是对于具有KRAS突变等难治性特征的肺腺癌，寻找能增强放疗敏感性的新靶点具有重要临床意义。

来自塔尔图大学的研究团队在《Scientific Reports》发表的研究中，创新性地采用10 Gy单次高剂量辐射（模拟临床立体定向放疗）处理两种典型肺腺癌细胞系HCC-44（PD-L1高表达，KRAS G12C突变）和A549（KRAS G12S突变），通过整合无标记质谱蛋白质组学、Western blot验证、免疫荧光成像和功能性实验等多维度方法，揭示了辐射诱导的蛋白质组重塑特征及其治疗转化价值。研究特别关注了不同培养条件（单层贴壁 vs 3D球体）对辐射应答的影响，为临床前研究模型选择提供了重要参考。

关键技术方法包括：1）10 Gy X射线辐射处理模拟临床立体定向放疗；2）无标记定量质谱技术全面分析蛋白质组变化；3）3D球体培养模型模拟肿瘤微环境；4）特异性抑制剂ALW-II-41-27和pepstatin A分别靶向EPHA2和CTSD的功能验证；5）TIRF显微镜技术检测膜定位蛋白动态变化。

研究结果

蛋白质组变化依赖于细胞系和培养模式

主成分分析显示不同细胞系和培养条件形成明显聚类，辐射处理组与对照组差异相对较小但可区分。质谱共鉴定5188种蛋白质，其中差异表达蛋白(DEP)数量最多出现在贴壁培养的A549细胞（48个DEP），其次是A549球体（33个DEP）和HCC-44细胞（29个DEP）。值得注意的是，贴壁培养的两种细胞系仅共享3个DEP（EPHA2、OPTN和MAP1B），而A549贴壁与球体培养共享15个DEP，表明培养模式显著影响辐射应答。

免疫染色证实辐射诱导EPHA2、IFG2R和TSPAN3水平升高

Western blot显示所有验证蛋白在辐射组均呈现表达升高趋势，其中IGF2R在A549球体中升高具有统计学意义（P<0.05）。免疫荧光进一步证实EPHA2在HCC-44细胞中辐射诱导增加显著（P<0.05），而IGF2R和TSPAN3在A549细胞中48小时即出现显著升高（P<0.001）。有趣的是，TIRF显微镜发现辐射后磷酸化EPHA2在质膜边缘富集，提示其激活状态改变。

辐射使贴壁NSCLC细胞对EPHA2抑制敏感

剂量反应曲线显示，EPHA2特异性抑制剂ALW-II-41-27对A549细胞的低剂量IC₅₀值达亚纳摩尔级。辐射显著增强了A549细胞对该抑制剂的敏感性（P<0.01），低剂量效应比例增加。多靶点抑制剂regorafenib也显示类似趋势，其高剂量IC₅₀值在辐射组显著降低（P<0.001）。CTSD抑制剂pepstatin A在A549细胞中同样表现出辐射增敏效应（P<0.001）。

球体形成实验揭示EPHA2的功能复杂性

ALW-II-41-27在0.3 nM浓度即可破坏A549球体结构（P<0.001），但非辐射球体更敏感。相反，regorafenib使辐射球体在更低浓度（800 nM vs 1.3 μM）出现体积缩小。PI染色显示ALW-II-41-27主要引起非辐射球体细胞死亡，而regorafenib的促凋亡效应与辐射状态无关。

研究结论与意义

该研究系统描绘了高剂量辐射诱导的肺腺癌细胞蛋白质组重塑图谱，首次在分子水平证实了EPHA2和CTSD作为放疗增敏靶点的治疗潜力。特别重要的是，研究发现EPHA2的辐射诱导表达具有细胞类型特异性（在HCC-44中更显著），而其抑制剂敏感性则呈现培养模式依赖性——在贴壁细胞中表现为辐射增敏，在3D球体中则主要影响结构完整性。这些发现为理解肿瘤微环境如何影响靶向治疗响应提供了新视角。

从转化医学角度看，研究支持将EPHA2靶向抗体药物偶联物(ADC)与立体定向放疗联合应用的开发策略。鉴于目前已有针对EPHA2的ADC进入早期临床试验，本研究为优化其与放疗的联合方案提供了重要理论依据。此外，发现CTSD这一溶酶体蛋白酶可能通过调控自噬途径影响放疗抵抗，为克服肿瘤治疗抵抗开辟了新思路。

研究也存在一定局限性，如仅使用两种细胞系且未进行动物实验验证。未来需要在更多临床前模型和患者样本中验证这些靶点的表达模式，并深入探索EPHA2经典（激酶依赖）与非经典（核定位依赖）信号通路在放疗抵抗中的相对贡献。这些工作将推动个性化放疗联合靶向治疗策略的发展，最终改善难治性肺癌患者的预后。