基于多组学整合分析揭示CHAD与骨质疏松关联及汉黄芩素体外促软骨形成作用

本研究针对骨质疏松症(OP)现有疗法副作用大、疗效不一的临床困境，通过整合bulk RNA-seq与scRNA-seq数据，首次系统鉴定出软骨黏附蛋白(CHAD)和II型胶原(COL2A1)作为OP关键靶点。研究人员采用分子对接技术从传统中药(TCM)库筛选出汉黄芩素(Wogonin)，实验证实其通过上调CHAD/COL2A1表达显著促进ATDC5细胞软骨分化，为开发新型OP治疗策略提供了理论依据和候选化合物。

　　

骨质疏松症(OP)如同骨骼的"隐形杀手"，悄悄侵蚀着全球数亿人的骨骼健康。这种以骨密度降低、骨折风险增加为特征的疾病，在绝经后女性中尤为猖獗，数据显示高达50%的西方女性会遭遇脆性骨折。当前临床主流的双膦酸盐类药物虽能抑制破骨细胞，却可能带来胃溃疡、下颌骨坏死等棘手副作用，而备受推崇的特立帕肽(Teriparatide)又存在高钙血症风险。面对这种"进退维谷"的治疗困境，四川大学华西口腔医院的研究团队另辟蹊径，将目光投向了传统中药(TCM)这座天然化合物宝库，同时聚焦于长期被忽视的"骨-软骨对话"机制。

研究人员创新性地采用多组学整合策略，首先通过分析GSE222752和PRJCA009927两个小鼠OVX(卵巢切除)模型的bulk RNA-seq数据集，结合GSE169396等人类单细胞测序(scRNA-seq)数据，在73个差异表达基因(DEGs)中锁定软骨黏附蛋白(CHAD)和II型胶原(COL2A1)作为核心靶点。借助TCMBank数据库筛选和PyRx分子对接技术，发现汉黄芩素(Wogonin)与靶蛋白具有最佳结合亲和力(-6.4 kcal/mol)。体外实验证实5μM汉黄芩素可显著促进ATDC5细胞软骨分化，上调CHAD/COL2A1表达，相关成果发表于《Scientific Reports》。

关键技术路线包含：1)整合小鼠OVX模型和人类OP患者的bulk RNA-seq与scRNA-seq数据；2)使用Seurat(v5.1.0)进行单细胞质控和聚类分析；3)基于STRING数据库构建蛋白互作网络(PPI)，MCODE算法识别hub基因；4)AutoDock Vina分子对接预测化合物结合能力；5)ATDC5细胞模型验证促软骨分化效应。

Bulk RNA sequencing analyses
通过火山图可视化显示OVX组与对照组的基因表达差异，维恩图鉴定出73个共同DEGs。PPI网络分析发现CHAD与MYBPC1、DNTT构成关键模块，其中CHAD在OP组显著下调。GO富集揭示这些基因主要参与肌细胞发育、肌动蛋白结合等过程。

Single cell RNA sequencing analyses
UMAP降维显示OP组中红细胞和脂肪细胞比例异常升高，而巨噬细胞/中性粒细胞减少。基质细胞亚群分析鉴定出COL2A1、CHAD、ACAN(聚集蛋白聚糖)等5个与bulk数据重叠的DEGs，HPA数据库证实它们在正常软骨高表达。LIANA分析发现OP组COL2A1-CD44互作网络受损。

Therapeutic drug prediction
特立帕肽治疗数据集显示其可上调CHAD/COL2A1表达并增加软骨细胞比例。分子对接热图显示汉黄芩素与四环藤碱(Tetrandrine)对靶蛋白具有最佳结合力，其中汉黄芩素与CHAD形成稳定氢键。

In vitro experiment
CCK-8实验证实汉黄芩素(5μM)无细胞毒性。qRT-PCR显示其处理12小时可使CHAD表达提升2.5倍，COL2A1增加1.8倍。阿尔新蓝染色显示汉黄芩素显著增强ATDC5细胞软骨基质分泌，而碱性磷酸酶(ALP)染色证实其不引起成骨分化。

这项研究开创性地揭示了CHAD在OP中的枢纽作用，其机制可能涉及调控软骨细胞分化与COL2A1-CD44信号轴。汉黄芩素的促软骨效应为开发"骨-软骨共治"的新型OP疗法提供了分子基础，其284.26 g/mol的分子量与双膦酸盐相当，更具临床转化潜力。未来研究需深入探索：1)CHAD如何调控巨噬细胞M1/M2极化；2)COL2A1阳性祖细胞在骨修复中的作用；3)汉黄芩素在体