新型单细胞保存与RNA测序技术开启疟原虫自然感染研究的现场应用新篇章

本研究针对疟原虫自然感染研究中单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术难以在资源匮乏地区应用的难题，开发了适配现场条件的样本处理与HIVE CLX单细胞保存测序技术。研究人员通过验证不同寄生虫富集方法，成功从6个样本中获得22,345个恶性疟原虫(Plasmodium knowlesi)单细胞转录组，构建了迄今最全面的恶性疟原虫单细胞数据集。该技术突破为揭示自然感染中疟原虫克隆多样性、生命周期动态及宿主-寄生虫互作机制提供了关键工具，将从根本上改变疟疾自然感染研究范式。

　　

疟疾作为全球重大传染病，其病原体疟原虫具有复杂的生命周期和显著的克隆多样性。传统实验室培养的疟原虫株系与自然感染种群存在基因表达差异，而自然感染样本常包含具有不同耐药性、毒力和免疫逃逸策略的混合克隆。尽管单细胞RNA测序(scRNA-seq)技术已成功应用于疟原虫发育轨迹重建和阶段特异性基因表达研究，但受限于样本处理、细胞保存和仪器需求，该技术此前几乎仅能用于实验室培养或动物模型，仅有一项研究分析了4例马里自然感染样本。如何在资源有限的疟疾流行区开展高质量单细胞研究，成为亟待解决的科学难题。

比利时热带医学研究所的Erin Sauve团队联合巴西圣保罗联邦大学的研究人员，在《Scientific Reports》发表创新性研究。团队首次将HIVE CLX单细胞测序技术应用于疟原虫研究，这种仪器无关、集成RNA保存功能的新型技术，通过微型蜂窝状微孔系统捕获单细胞，配套保存液可实现样本长期冻存和干冰运输。研究人员设计了两套适用于现场条件的样本处理方案：PNyco方法结合白细胞过滤与Nycodenz密度梯度离心；MACSPS方法则利用磁性分选柱(MACS)基于疟色素特性富集滋养体和裂殖体，再通过皂素裂解分离环状体。通过比较离心与重力加载方式，最终从模拟自然感染样本和体外培养样本中成功获取22,345个高质量单细胞转录组。

关键技术包括：1）采用HIVE CLX系统进行无仪器单细胞捕获与RNA保存；2）优化PNyco和MACSPS两种寄生虫富集流程；3）基于Seurat软件包进行单细胞数据分析；4）利用Malaria Cell Atlas(MCA)参考数据集进行生命周期阶段注释；5）应用Slingshot算法构建发育轨迹。

Processing Plasmodium natural infection samples to recover all intraerythrocytic life stages
通过模拟自然感染样本验证，PNyco方法使寄生虫富集度达16%，MACSPS法则实现环状体、滋养体和裂殖体的分步回收。密度梯度离心显示，Percoll法特异性富集裂殖体(占66%)，而Nycodenz法更均衡保留各发育阶段。

Validation of single-cell RNA sequencing using HIVE technology
UMAP降维分析显示所有样本均呈现可重复的环形投影，7个Louvain聚类位置一致。伪批量分析显示样本间基因表达高度相关(Pearson's R>0.88)，标志基因表达模式与预期相符：微管蛋白(pktubulin)全周期表达，裂殖体表面蛋白msp8和msp1分别标记早期和晚期血液阶段，侵袭相关基因DBPα和NBPXa特异性高表达于晚期裂殖体。

Life stage annotation and composition by enrichment method
通过scmap算法基于MCA参考数据集注释显示，所有样本均成功回收环状体、滋养体和裂殖体阶段。重力加载获得更高比例的环状体(8-10% vs 离心法1-4%)，而离心加载的MACSPS样本细胞回收量提高3倍(7,532个细胞)。Percoll梯度使裂殖体占比达53%，显著高于Nycodenz法的27%。

该研究首次证实HIVE技术可用于单细胞寄生虫研究，创建了最大的恶性疟原虫单细胞数据集。创新性样本处理方法解决了自然感染研究中人类遗传物质干扰、寄生虫密度低和设备限制等核心难题。特别值得注意的是，该技术突破使在缺乏超低温冰箱的偏远地区开展单细胞研究成为可能，为揭示自然感染中克隆互作、耐药机制和宿主适应性等关键生物学问题提供了全新研究范式。研究建立的标准化流程将显著推动对难以培养的间日疟原虫(Plasmodium vivax)等虫种的研究，为疟疾防控策略制定提供重要科学依据。