基于多光谱免疫荧光引导的H&E病理图像自动化细胞注释与空间生物标志物发现

本研究针对传统病理学中人工细胞注释效率低、误差率高的问题，开发了一种结合多光谱免疫荧光(mIF)和H&E染色图像配准的自动化细胞分类框架。通过单细胞级配准技术将mIF定义的细胞谱系标记转移至H&E图像，构建了包含1,127,252个高质量标注细胞的数据库，并开发了结合自监督学习与域适应的深度学习模型，在四类细胞分类中达到86%-89%准确率。该研究首次揭示了淋巴细胞-中性粒细胞空间相互作用与免疫治疗响应的显著关联，为基于常规病理的精准肿瘤学提供了可扩展的单细胞分析方案。

　　

在临床诊断中，苏木精-伊红(H&E)染色组织病理学是金标准，但其复杂的细胞组成解读长期依赖病理医师经验。传统人工细胞注释存在观察者间差异大、对形态相似细胞(如巨噬细胞)识别一致性仅约50%等局限，且劳动密集型特性导致标注细胞数量有限。更棘手的是，现有基于图像分块的AI模型缺乏细胞级解析能力，难以揭示肿瘤微环境(TME)中关键的空间相互作用模式。

为解决这些瓶颈，斯坦福大学与南方医科大学的研究团队在《Nature Communications》发表创新性研究。该工作通过连续多光谱免疫荧光(mIF)和H&E染色技术，以5种细胞谱系标记物(pan-CK、CD3、CD20、CD66b、CD68)定义了肿瘤细胞、淋巴细胞、中性粒细胞和巨噬细胞四类细胞，并开发单细胞级图像配准算法将mIF标注转移至H&E图像，构建了迄今最大规模的自动化标注病理数据集(1,127,252细胞)。研究整合自监督学习与梯度反转层(GRL)域适应技术，开发的深度学习模型在外部验证集达到86.4%分类准确率，显著优于人工标注训练的模型(56.2%)。关键技术包括：mIF-H&E序列染色与单细胞配准、BYOL自监督预训练、基于组织微阵列(TMA)和TCGA全切片图像(WSI)的多中心验证等。

研究设计
通过mIF成像获取细胞谱系蛋白标记表达谱，采用Leiden聚类算法替代人工阈值设定，确保细胞分型的客观性。配准精度验证显示细胞间平均距离3.1μm，低于细胞核平均直径7.6μm。

细胞分类性能
模型在训练集、内部验证集和外部验证集的AUC分别为0.980、0.972和0.964。UMAP可视化显示肿瘤细胞与中性粒细胞形态特征差异显著，而与巨噬细胞存在部分重叠，符合病理学认知。特别值得注意的是，模型预测的细胞密度与RNA-seq反卷积结果相关性(r=0.61)显著优于人工标注(r=0.11)。

空间生物标志物发现
在8种癌症3297例患者中，淋巴细胞50邻域内中性粒细胞比例这一空间特征与预后显著相关(HR 1.91-5.75)。针对免疫检查点抑制剂(ICI)治疗的胃癌队列，基于空间特征构建的预测模型在验证集达到AUC 0.817，较PD-L1联合阳性分数(CPS)提升25.7%，且独立于MSI状态和HER2表达。

这项研究突破了传统病理分析的三大局限：首次实现H&E图像中免疫细胞亚型的自动化高精度识别；创建了可解析百万级单细胞的空间相互作用图谱；揭示了中性粒细胞空间分布作为新型免疫治疗预测标志物的潜力。该框架仅需常规H&E切片即可应用，为临床转化提供了极高可行性的解决方案。技术突破在于将mIF的金标准特性与深度学习的扩展性完美结合，其中域适应策略有效克服了机构间染色差异的挑战。未来整合CODEX等高复用成像技术，有望进一步扩展可识别的细胞类型谱系，深化对肿瘤生态系统的理解。