铜绿假单胞菌ftsI基因特异性变异降低碳青霉烯类抗生素敏感性的分子机制与临床意义

这篇研究通过构建重组菌株系统评估了铜绿假单胞菌(P. aeruginosa)中ftsI基因（编码PBP3蛋白）的8个临床常见错义突变对β-内酰胺类抗生素敏感性的影响。研究发现位于青霉素结合(PB)结构域的7个突变（Met460Thr/Val471Gly/Arg504Cys/Pro527Thr/Pro527Ser/Phe533Leu/Val537Leu）可降低碳青霉烯类（meropenem/doripenem）敏感性2-8倍，但意外增加cefiderocol和piperacillin敏感性。通过晶体结构分析揭示了突变通过影响Tyr409/Arg489等关键残基的构象变化介导耐药，为碳青霉烯耐药菌(CR-PA)的精准治疗提供理论依据。

　　

ABSTRACT
铜绿假单胞菌的ftsI基因编码青霉素结合蛋白3(PBP3)，是β-内酰胺类抗生素的主要作用靶点。最新基因组监测显示17%的碳青霉烯耐药株(CR-PA)携带ftsI非同义突变。研究通过同源重组技术在敏感菌株YM64（缺失四种mex外排泵）中引入8个临床突变，发现PB结构域的7个突变使meropenem/doripenem最低抑菌浓度(MIC)提升2-8倍，其中Arg504Cys突变还使cefepime MIC升高4倍。生长曲线分析显示这些突变反而增加细菌对cefiderocol和piperacillin的敏感性。

INTRODUCTION
青霉素结合蛋白(PBPs)是细菌肽聚糖合成的关键酶类。铜绿假单胞菌拥有8种PBPs，其中PBP3(ftsI编码)是唯一必需的高分子量(HMM) PBP。既往研究发现临床分离株在碳青霉烯压力下会出现ftsI突变，但混杂遗传背景干扰了突变表型的准确评估。研究团队通过分析1,297株CR-PA基因组，鉴定出41个ftsI非同义突变，重点研究了8个在日本流行株中高频出现的突变。

RESULTS
Nonsynonymous substitutions in ftsI
全球CR-PA基因组分析显示，9.8%菌株在PBP3的PB结构域携带突变。选择频率>1%的8个突变（Leu89Val/Met460Thr/Val471Gly/Arg504Cys/Pro527Thr/Pro527Ser/Phe533Leu/Val537Leu）进行功能验证，其中Arg504Cys在ST235等高危克隆中广泛分布，Phe533Leu更是中国ST463菌株的标志性突变。

Susceptibility profiles
PB结构域突变使doripenem MIC提升最显著（4-8倍），meropenem次之（2-8倍）。Arg504Cys作为最常见突变，还使cefepime MIC升高4倍，ceftolozane-tazobactam MIC升高2倍。意外的是，所有PB结构域突变均降低cefiderocol MIC至≤0.031 μg/mL，其中Val471Gly等5个突变还使piperacillin MIC减半。

Growth parameter analysis
在含meropenem(0.125 μg/mL)培养基中，PB突变株的曲线下面积(AUC)达到野生型的160%-230%。值得注意的是，虽然imipenem MIC未显著变化，但突变株的延滞期明显缩短。Arg504Cys在cefepime环境中最大生长斜率提升157%，而所有PB突变株在cefiderocol环境中的AUC降低15%-35%。

Molecular interactions
晶体结构解析揭示：

• Phe533Leu破坏与Val333形成的疏水柱，影响meropenem的C2位吡咯烷稳定
• Val537Leu通过增强与Tyr532/Asn242相互作用阻碍构象变化
• Arg504Cys突变破坏与Asp525的盐桥，间接影响Tyr409/Arg489对ceftazidime氨基噻唑环的稳定作用
• Met460Thr通过Leu346-Leu461-Gly483网络削弱KSGT模体与meropenem羧酸基团的结合

DISCUSSION
本研究首次系统证实PB结构域7个突变是铜绿假单胞菌适应碳青霉烯的选择标记。值得注意的是，这些突变呈现"耐药-增敏"的双向调控：在获得碳青霉烯耐药性的同时，增强了对cefiderocol（新型铁载体头孢菌素）的敏感性。Arg504Cys作为"广谱适应突变"，可同时应对碳青霉烯和头孢类药物的选择压力。研究为CR-PA的精准用药提供了重要依据——对于携带PB结构域突变的菌株，cefiderocol或成为优选治疗方案。

MATERIALS AND METHODS
使用pEX18Tc载体在YM64菌株（PAO1ΔmexAB-oprMΔmexCD-oprJΔmexEF-oprNΔmexXY）中进行等位基因替换。药敏试验采用CLSI推荐的微量肉汤稀释法，生长参数通过grofit软件包分析OD₆₀₀动力学曲线获得。分子对接基于PDB数据库的3PBR(PBP3-meropenem复合物)和3PBO(PBP3-ceftazidime复合物)结构开展。