呼吸道微生物组研究新突破：宿主DNA去除方法的优化与上下呼吸道微生物差异解析

本研究针对呼吸道微生物组测序中宿主DNA干扰严重和上下呼吸道样本代表性差异两大挑战，系统评估了7种宿主DNA去除方法（包括新型F_ase法）在支气管肺泡灌洗液（BALF）和口咽拭子（OP）样本中的表现。研究发现所有方法均能显著提高微生物读长比例（BALF中最高提升100.3倍）和基因组覆盖度，但会引入分类偏差（如Prevotella spp.和Mycoplasma pneumoniae显著减少）。通过高分辨率微生物组分析，首次揭示16.7%的BALF高丰度病原体在OP样本中低表达（<0.1%），为呼吸道感染诊断和微生态研究提供方法学优化方案。

　　

呼吸道作为人体与外界环境交互的重要界面，其微生物组的平衡与呼吸系统健康密切相关。然而，当科学家们试图通过宏基因组测序（mNGS）技术解析呼吸道微生物组成时，却面临两大"拦路虎"：样本中高达99%的宿主DNA会掩盖微弱的微生物信号，而临床常用的口咽拭子能否真实反映下呼吸道感染状况也备受争议。这些瓶颈严重制约着呼吸道病原体检测的灵敏度和呼吸道微生态研究的深度。

来自深圳第三人民医院等机构的研究团队在《npj Biofilms and Microbiomes》发表的重要研究，系统评估了7种宿主DNA去除方法（包括新开发的F_ase过滤酶解法）在35例BALF和34例配对OP样本中的表现。通过qPCR定量、物种/基因丰度分析和模拟群落验证等系列实验，结合高分辨率微生物组分析，不仅建立了针对不同呼吸道样本的优化方案，更揭示了上下呼吸道微生物组的传递规律和生态偏好。

研究采用三大关键技术：1）7种宿主DNA去除方法平行比较（含新型10μm过滤酶解法F_ase）；2）34对BALF-OP样本的配对宏基因组测序；3）15种呼吸道菌株构建的模拟群落验证体系。通过定量PCR和生物信息学分析，系统评估了宿主去除效率、微生物保留率、分类偏差等核心指标。

实验设计及呼吸道样本特征
BALF样本展现出"大海捞针"般的检测挑战：微生物DNA仅占总量0.02%（宿主DNA占比99.98%），而OP样本中微生物比例可达12.5%。所有处理方法使宿主DNA降低1-4个数量级，其中皂苷酶解法（S_ase）和Zymo试剂盒（K_zym）表现最佳，使82.35%的OP样本宿主DNA低于检测限。

宿主DNA去除提升分类与基因组分辨率
在BALF样本中，K_zym使微生物读长比例提升100.3倍，基因家族检出增加41.4倍。值得注意的是，当原始样本微生物比例>10%时，物种丰富度提升效果消失，提示宿主去除需"因样制宜"。

对微生物组分析保真度的影响
尽管患者个体差异解释了49.64%的微生物变异（p<0.001），但不同方法仍造成3.29%的组成偏移。新型F_ase法与参比方法（R_ase）的Jensen-Shannon距离最小（BALF中位数0.24），且引入污染物最少（<4.21%），展现出最优的保真性。

上下呼吸道微生物组比较
高分辨率分析揭示：肺炎患者中16.7%的BALF高丰度病原体（>1%）在OP中几乎检测不到（<0.1%）。韦荣球菌（Veillonella）在OP中丰度更高，但其菌株多样性在BALF中更丰富，63个SNP差异位点（含14个维生素B₁₂合成相关突变）暗示生态位适应性进化。

这项研究为呼吸道感染诊断提供了方法学"导航图"：对于微生物极低的BALF样本，推荐F_ase或S_ase法；而OP样本可直接采用R_ase法。发现上下呼吸道存在显著菌株级差异，警示临床OP采样可能遗漏16.7%的下呼吸道病原体。研究建立的标准化流程将推动呼吸道微生态研究进入单核苷酸分辨率时代，为精准诊断和微生态干预奠定基础。