基于随机诱变与中心复合设计优化枯草芽孢杆菌VIT MS2高产纳豆激酶及其抗血栓应用研究

研究人员针对全球心脑血管疾病高死亡率问题，通过随机诱变和中心复合设计(CCD)优化枯草芽孢杆菌VIT MS2的纳豆激酶(NK)产量。研究利用农业废弃物替代培养基成分，使酶产量提升37.75倍至4639.43±10.65 FU/mL，并通过MALDI-TOF验证纯度。该成果为开发低成本、高效的溶栓疗法提供新策略。

　　

心血管疾病是全球死亡的首要原因，其中血栓相关疾病如心肌梗死和缺血性卒中每年导致数百万人死亡。尽管现有溶栓药物如链激酶和尿激酶能有效治疗血栓，但其高昂成本和副作用限制了广泛应用。纳豆激酶(Nattokinase, NK)作为一种源自传统日本发酵食品纳豆的丝氨酸蛋白酶，具有强效溶栓、抗炎和抗氧化特性，且无显著副作用，因此成为新型溶栓疗法的研究热点。然而，天然菌株的NK产量低、生产成本高成为制约其临床应用的关键瓶颈。

针对这一挑战，来自韦洛尔理工学院(Vellore Institute of Technology)的研究团队开展了一项创新研究，通过物理化学诱变结合统计优化技术，显著提升了枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis) VIT MS2菌株的NK产量。研究成果发表在《BMC Microbiology》上，为开发经济高效的溶栓疗法提供了重要技术突破。

研究主要采用四种关键技术方法：(1) 紫外线(UV)和乙基甲烷磺酸盐(EMS)诱变筛选高产突变株；(2) 中心复合设计(CCD)优化含农业废弃物的培养基配方；(3) 纤维蛋白降解实验和部分凝血块溶解试验评估酶活性；(4) MALDI-TOF质谱和RP-HPLC验证酶纯度。研究使用的突变菌株源自发酵豇豆乳中分离的野生型菌株。

研究结果

物理化学诱变提升菌株性能
通过UV照射(265 nm)和EMS处理构建突变库，UVBS-18突变株在60分钟照射后活性达1034.18 FU/mL，致死率50%；经30μg/mL EMS处理的EMSBS-14突变株活性进一步提升至1240±1.09 FU/mL，较野生型(122.9±0.06 FU/mL)提高10倍。

农业废弃物培养基优化
采用甘蔗糖蜜、豆粕废料、蛋壳粉和啤酒糟替代传统培养基成分，通过CCD设计30组实验。最优组合(10%糖蜜、12.5 g/L豆粕、12.5 g/L蛋壳粉、27.5 g/L啤酒糟)使产量达4639.43±10.65 FU/mL，模型R²=0.9963显示高度可靠性。

酶学特性验证
纯化后NK比活性达86,593.32±3.44 FU/mg，纯度经HPLC(保留时间10.356 min)和MALDI-TOF(29 kDa单峰)确认。部分凝血块溶解率达98.7±1.0%，优于阳性对照链激酶。

研究意义

该研究通过创新性地结合随机诱变和统计优化，将NK产量提升至文献报道值的2-9倍，同时利用农业废弃物降低生产成本60%以上。突变菌株的遗传稳定性与酶的高比活性，为其工业化生产奠定基础。鉴于NK在阿尔茨海默病、高血压等领域的潜在应用，该成果不仅为心血管疾病治疗提供新选择，也为其他微生物源治疗酶的开发提供了可借鉴的技术路线。未来通过基因工程进一步优化菌株，有望实现NK疗法的临床转化。