病毒诱导基因沉默技术下棉花抗虫研究中稳定内参基因的筛选与验证

本研究针对棉花病毒诱导基因沉默(VIGS)研究中内参基因稳定性未充分评估的问题，通过多算法(ΔCt/geNorm/NormFinder)系统评估了GhACT7等6个候选基因在蚜虫胁迫下的表达稳定性。研究发现GhUBQ7/GhUBQ14稳定性最差，而GhACT7/GhPP2A1组合能准确检测GhHYDRA1基因在虫害中的2.4倍上调表达，为棉花-害虫互作研究提供了关键标准化工具。

　　

棉花作为全球重要的经济作物，长期面临蚜虫等害虫的威胁。虽然转基因Bt棉花已广泛应用，但害虫抗性日益严重，亟需开发新型防控策略。病毒诱导基因沉默(VIGS)技术因其在复杂四倍体棉花基因组研究中的独特优势，成为解析棉花-害虫互作机制的重要工具。然而，在VIGS研究中，逆转录定量PCR(RT-qPCR)的准确性高度依赖内参基因的稳定性，此前却缺乏系统评估——特别是在生物胁迫条件下。

针对这一关键问题，美国德克萨斯农工大学(Texas A&M University)昆虫学系的Mason K. Clark团队设计了一项创新研究。他们通过完全析因实验，结合多种统计方法，首次系统评估了VIGS和蚜虫双重胁迫下棉花内参基因的稳定性，并将成果发表在《Scientific Reports》上。

研究采用三项关键技术：1) 烟草脆裂病毒(TRV)载体构建的VIGS系统侵染棉花；2) 棉花蚜虫(Aphis gossypii)生物胁迫模型建立；3) 多算法联合分析(ΔCt/geNorm/BestKeeper/NormFinder/加权秩聚合)评估GhACT7等6个候选基因的表达稳定性。实验样本来自德州本地棉田的"Tamcot 73"品种，通过农杆菌浸润法实现基因沉默。

Ct值和ΔCt分析
研究首先检测了候选基因的Ct值范围(21.7-30.6)，发现GhUBQ7的变异系数最高(SD=3.28)。ΔCt分析显示，蚜虫侵染仅影响GhTMN5表达，而时间因素显著影响GhACT7/GhPP2A1/GhTBL6的稳定性(p<0.01)。

表达稳定性算法比较

geNorm和NormFinder一致将GhUBQ7/GhUBQ14列为最不稳定基因，而GhACT7/GhPP2A1始终排名前两位。BestKeeper分析则显示GhTBL6变异最小(CV=1.54)，但该结果与其他算法存在矛盾。

验证实验的关键发现

当采用GhACT7/GhPP2A1标准化时，能检测到蚜虫侵染14天后GhHYDRA1显著上调2.4倍(p=0.0001)；而使用GhUBQ7时，尽管检测到4倍表达变化却无统计学意义。bootstrap分析证实前者标准化结果的SD值(0.62)显著低于后者(4.95)。

这项研究首次明确了VIGS和蚜虫双重胁迫下棉花RT-qPCR的最佳内参基因组合。其重要意义体现在三方面：1) 纠正了领域内长期使用不稳定内参基因(GhUBQ系列)的误区；2) 为棉花-害虫互作研究提供了经过验证的标准化方案；3) 通过GhHYDRA1案例证实了植物甾醇代谢在抗蚜反应中的作用，为开发新型抗虫策略提供了分子靶点。研究采用的加权秩聚合分析方法，也为复杂条件下内参基因筛选建立了新范式。

值得注意的是，GhACT7/GhPP2A1在长时间胁迫下稳定性会降低，这提示未来研究需根据实验周期调整标准化策略。该团队建议，在涉及VIGS的棉花抗虫研究中，应采用双内参基因策略，并优先选择功能不相关的基因组合(如GhACT7+GhPP2A1)以抵消潜在共调控影响。这些发现将显著提升棉花功能基因组研究的可靠性，助力新型抗虫棉花的精准设计。