过氧化物酶体膜蛋白Pex3驱动细胞器间接触位点形成的跨物种机制研究

本研究针对细胞器接触位点形成机制不明的问题，通过过表达保守蛋白Pex3，首次在酿酒酵母和黑腹果蝇中揭示了其诱导过氧化物酶体-过氧化物酶体（Pex-Pex）及过氧化物酶体-脂滴（Pex-LD）接触位点的能力。研究发现Pex3胞质域直接介导同型接触，而脂滴接触依赖脂酶Tgl4（非酶活依赖性），并通过全基因组筛选鉴定出能量代谢相关通路调控Tgl4定位。该工作为细胞器互作网络提供了新分子机制，对理解代谢疾病中细胞器协作障碍具有重要意义。

　　

论文解读

研究背景与科学问题

真核细胞中，过氧化物酶体（peroxisome）是脂肪酸β-氧化（β-oxidation）和活性氧代谢的核心场所，其功能异常导致多种人类疾病（如过氧化物酶体紊乱症）。近年研究发现，过氧化物酶体通过膜接触位点（membrane contact sites）与内质网、线粒体等细胞器互作，调控其增殖、定位与代谢物质交换。然而，同型接触（过氧化物酶体间互作）及与脂滴（lipid droplet, LD）异型接触的分子机制仍不清楚。Pex3作为过氧化物酶体膜蛋白，已知参与膜蛋白靶向（依赖Pex19）和自噬（依赖Atg36），但其在接触位点形成中的作用仅在小肠杆菌（Hansenula polymorpha）中有初步报道。

研究设计与主要方法

德国奥斯纳布吕克大学（Osnabrück University）的研究团队通过多物种模型（酿酒酵母、黑腹果蝇）结合前沿技术展开研究：

1. 过表达表型分析：在酵母中强启动子（TEF1pr）驱动Pex3表达，利用荧光标记（mCherry-SKL标记过氧化物酶体基质，Bodipy染色脂滴）观察细胞器形态变化。
2. 邻近标记与蛋白质组学：Pex3-TurboID生物素化邻近蛋白，质谱鉴定互作组分。
3. 高分辨率成像：
   • 冷冻电子断层扫描（CLEM tomography）：对过表达细胞进行关联显微成像，三维重建接触位点超微结构（图2C-F）。
   • 扩大细胞器策略：敲除PEX11基因并添加油酸（oleate）诱导，增大过氧化物酶体和脂滴以便界面分析（图2A-B, 5F）。
4. 遗传筛选：
   • 全基因组删除库筛选破坏Pex3过表达表型的基因（图5A）。
   • Tgl4定位调控因子筛选（补充图6）。
5. 功能验证：
   • 关键基因敲除（如△TGL4、△ATG36、△INP1）及点突变（Tgl4-S315G失活突变）。
   • 人工锚定系统测试Pex3胞质域（Pex3(CD)）的拴系能力（图3D-F）。
6. 跨物种验证：果蝇肠道组织过表达Pex3，观察细胞器形态（图6）。

核心研究结果

1. Pex3过表达诱导细胞器聚集与接触位点形成（图1-2）

• 酵母中过表达Pex3使过氧化物酶体聚集成单簇结构（平均数量从5.5降至1），95%被脂滴包围（图1A-D）。
• CLEM断层扫描证实簇结构含Pex-Pex及Pex-LD接触位点，膜间距≤30 nm（图2C-F）。
• 脂滴缺失株（△LDs）中仍形成过氧化物酶体簇，表明Pex-Pex接触独立于脂滴（图2G-H）。

2. Pex3胞质域直接介导同型接触（图3）

• 表达可溶性Pex3胞质域（GFP-Pex3(CD)）特异性结合过氧化物酶体膜（Manders系数M1=0.92）（图3B-C）。
• 人工锚定Pex3(CD)至线粒体（Tom70-NB-Alfa系统）后，显著缩短过氧化物酶体-线粒体距离（p<0.0001），证明其拴系能力（图3E-F）。

3. 接触位点形成独立于已知Pex3互作因子（图4）

• 敲除Pex19互作因子（Atg36、Inp1）或Pex19结合缺陷突变体（Pex3^W128K,L131K）均不影响簇结构形成（图4B-G, L-N）。
• Pex3过表达不诱导pexophagy（过氧化物酶体自噬）（图4H）。

4. Tgl4特异性调控Pex-LD接触（图5）

• 全基因组筛选发现△TGL4显著降低Pex-LD接触频率（95%→51%），而△TGL3/△TGL5无效（图5B-C）。
• Tgl4酶活非必需（S315G突变不影响接触），但其在接触界面富集（图5D-G）。
• 脂酶Tgl3/Tgl5同样界面富集，但频率较低（图5G）。
• Tgl4定位调控因子涉及能量代谢、缺氧信号通路（补充图6，表5）。

5. 表型跨物种保守（图6）

• 果蝇肠道过表达Pex3导致过氧化物酶体增大、数量减少，与脂滴形成紧密接触（形态互锁）（图6B-I）。
• 成虫肠道表型更显著（脂滴面积增加3倍），证实机制保守性（图6F-H）。

结论与意义

本研究首次揭示Pex3的双重功能：其胞质域直接介导过氧化物酶体同型接触，而过表达诱导的脂滴接触则依赖脂酶Tgl4（非酶活依赖性的支架作用）。突破性发现包括：

1. 新型接触位点机制：发现首例脂滴定位的接触位点调节因子（Tgl4），拓展了代谢细胞器互作网络。
2. Pex3多功能性进化：在不同物种中，Pex3通过结构域特异性互作参与多种接触位点（酵母中同型/脂滴接触，小肠杆菌中液泡接触）。
3. 代谢调控意义：脂滴-过氧化物酶体接触可能优化脂肪酸从脂解到β-氧化的转运效率，为脂代谢疾病提供新视角。
4. 技术启示：建立的高通量接触位点筛选策略（如Tgl4定位调控因子库）可推广至其他细胞器互作研究。

该成果发表于《Scientific Reports》，为细胞器互作领域提供了关键分子工具（Pex3过表达模型）和机制范式，未来可通过分离功能突变体进一步解析Pex3/Tgl4在生理条件下的精确作用。

（注：文中所有蛋白名称及遗传学术语均按原文大小写格式呈现，专业术语首现时标注英文全称/缩写）