单细胞深度高效甲基化测序技术scDEEP-mC揭示细胞谱系、X染色体失活状态及DNA复制动态的表观遗传调控

本研究通过开发高覆盖度的单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序技术scDEEP-mC，解决了现有单细胞DNA甲基化检测方法覆盖度低、等位基因分辨率不足等技术瓶颈。研究人员在《Nature Communications》发表的研究中，实现了单细胞水平上30% CpG位点的覆盖度，首次在单细胞中完成X染色体失活状态鉴定、半甲基化（hemi-methylation）动态监测以及DNA复制过程中甲基化维持机制解析，为发育生物学和疾病表观遗传学研究提供了突破性技术工具。

　　

在生命科学领域，单细胞表观遗传学研究长期面临重大技术挑战。传统单细胞全基因组亚硫酸氢盐测序（scWGBS）方法存在文库构建效率低、CpG位点覆盖不足等问题，导致研究者不得不依赖大基因组区间（甚至百万碱基级别）的甲基化数据平均化分析，这严重阻碍了对增强子、启动子等关键调控元件的精细解析。更棘手的是，现有技术难以实现等位基因特异性甲基化（allele-resolved methylation, ARM）分析，使得X染色体失活（X-inactivation）状态判定、DNA复制过程中半甲基化（hemi-methylation）动态等基础生物学问题在单细胞层面长期悬而未决。

美国Van Andel Institute的研究团队在《Nature Communications》发表突破性研究成果，开发出单细胞深度高效甲基化分析技术scDEEP-mC（single-cell Deep and Efficient Epigenomic Profiling of methyl-C）。该技术通过优化后亚硫酸氢盐适配体标记（PBAT）流程，结合特异性设计的随机引物系统，实现了单细胞30% CpG位点的覆盖度，较现有方法提升5-10倍。研究不仅成功应用于肠道上皮细胞亚群鉴定，更首次在单细胞层面揭示：1）DNA复制过程中滞后复制区域存在持续性半甲基化现象；2）X染色体失活状态可通过甲基化模式无SNP分型推断；3）转录因子SOX2结合位点存在特异性半甲基化富集特征。这些发现为理解表观遗传维持机制、细胞命运决定等基础问题提供了全新视角。

关键技术方法包括：1）直接细胞分选至亚硫酸氢盐转化缓冲液的免纯化建库流程；2）碱基组成匹配的随机九聚体引物设计（含1% CpG上下文特异性引物）；3）双链特异性标记的定向文库构建；4）基于Biscuit流程的甲基化调用与等位基因分析；5）非负矩阵分解（NMF）算法驱动的无监督细胞分型。实验样本涵盖原代小鼠肠道上皮细胞（CB6F1/J品系）和人原代成纤维细胞（AG06561系）。

【细胞类型与状态分析】通过分析50,286个细胞类型特异性低甲基化区域，成功区分肠道上皮细胞（成熟肠细胞与未分化细胞）和免疫细胞（T细胞与B细胞）亚群。非负矩阵分解（rank-2 NMF）在完全无监督条件下准确重现细胞分类结果，证实scDEEP-mC数据可支持高分辨率细胞分型。

【等位基因特异性甲基化】开发新型双链特异性ARM分析流程，实现单细胞百万级CpG位点的等位基因分配。在杂交小鼠（C57BL/6×BALB/c F1）中，单个细胞即可完整解析印记基因Gnas的三个差异甲基化区域（DMRs）。发现转录因子结合位点（TFBS）存在细胞类型特异性半甲基化模式：肠道上皮细胞中Cdx2位点、免疫细胞中Gata3位点分别呈现显著富集。

【DNA复制动态】结合复制时序（Repli-seq）数据，首次在单细胞层面观察到：1）滞后复制区域存在更高比例的半甲基化状态（早期传代细胞中达15%）；2）S期细胞早期复制区域读段数增加33.5%，伴随ARM不一致率升高；3）G2期细胞全基因组完成复制后，半甲基化比例仍高于G1期7.3%，提示甲基化维持存在滞后效应。

【X染色体失活表观遗传学】建立不依赖SNP分型的X失活状态推断方法：1）通过CpG岛甲基化差异准确区分活性（Xa）与非活性（Xi）X染色体（小鼠中准确率>99%）；2）发现Xist和Dxz4大卫星DNA邻近CpG岛在Xa上异常甲基化；3）长期培养的人成纤维细胞显示X失活状态趋同现象，但拷贝数分析排除X染色体丢失假说，证实为群体漂变（population drift）所致。

这项研究在方法学层面实现了三大突破：1）将单细胞甲基化检测分辨率提升至调控元件级别；2）首次实现无扰动条件下的DNA复制甲基化动态监测；3）建立X失活状态的无SNP分型判定标准。理论意义上，发现SOX2结合位点的特异性半甲基化特征支持其作为"超级先锋因子"通过抑制维持甲基化实现被动去甲基化的新机制。技术应用上，scDEEP-mC为研究衰老（如Hutchinson-Gilford早衰症）、癌症等疾病的表观遗传失调提供了全新工具。研究者特别指出，该方法可直接应用于原代细胞分析，这对人类组织样本研究具有重要价值。未来与STORM-seq等单细胞多组学技术的整合，有望进一步揭示转录与甲基化的时空耦合规律。