LGR4受体通过Norrin与RSPOs的差异结构调控机制揭示Wnt/β-catenin信号通路精准调控新范式

本研究针对Wnt/β-catenin信号通路调控机制的关键科学问题，通过冷冻电镜技术解析了LGR4受体与Norrin及R-spondins(RSPOs)的复合物结构，首次揭示了二者通过空间位阻和部分重叠结合位点实现信号分化的分子机制。研究发现Norrin以2:2化学计量比桥接LGR4形成独特构象，其与Frizzled4(FZD4)受体的竞争性结合建立了信号检查点，而疾病相关突变图谱为Norrie病与家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)提供了结构解释。研究还开发出能同时阻断Norrin/RSPOs的高亲和力纳米抗体NB18，为靶向Wnt通路相关疾病治疗提供了新工具。

　　

在生命活动的精密调控网络中，Wnt/β-catenin信号通路如同交响乐指挥，协调着胚胎发育、组织稳态和干细胞增殖等重要生物学过程。这条通路的异常激活与癌症、纤维化等重大疾病密切相关，而其精确调控机制一直是科学家们探索的焦点。其中，被称为"血管守护者"的Norrin蛋白和R-spondins(RSPOs)蛋白家族作为关键调控因子，通过结合富含亮氨酸重复序列的G蛋白偶联受体LGR4/5/6，在视网膜血管发育和屏障功能维持中发挥核心作用。然而，这些配体如何通过同一受体LGR4触发截然不同的信号输出？疾病相关突变如何影响这些相互作用？这些谜题长期困扰着研究人员。

为破解这些难题，中国科学院上海药物研究所等机构的研究团队在《Nature Communications》发表了突破性研究成果。研究采用冷冻电镜技术解析了全长LGR4-Norrin复合物的高分辨率结构，结合功能实验和纳米抗体开发，系统阐明了LGR4受体差异调控Wnt信号通路的分子机制。

研究主要运用了以下关键技术：冷冻电镜单颗粒分析技术解析2:2化学计量比的LGR4-Norrin复合物结构；生物层干涉技术(BLI)定量测定蛋白互作亲和力；TOPFlash荧光素酶报告基因系统评估Wnt信号活性；CRISPR-Cas9构建LGR4基因敲除细胞模型；骆驼源纳米抗体筛选与改造技术开发LGR4抑制剂。

LGR4-Norrin复合物的结构特征
冷冻电镜结构显示，Norrin以二聚体形式桥接两个LGR4分子，形成空间构象独特的2:2复合物。与LGR4-RSPO2-ZNRF3复合物相比，LGR4-Norrin中受体跨膜域间距达184?，且存在38.4°的头部倾斜角度。这种特殊几何排布提示Norrin可能通过膜曲率依赖或细胞间相互作用方式激活信号。

Norrin与LGR4的分子识别机制
结构分析揭示Norrin通过β1-β2链及其连接环与LGR4的LRRNT-LRR10区域结合，形成1483?²的相互作用界面。关键残基如LGR4的H207/H209与Norrin的K54/S57构成亲水相互作用网络，而V109/W159等形成疏水核心。双突变实验证实H207N/H209T显著削弱Norrin诱导的信号激活，验证了结构预测的功能位点。

疾病突变的分子分型机制
研究发现Norrin与FZD4和LGR4的结合存在空间位阻，二者无法同时结合。突变图谱显示：影响LGR4特异性结合（如R41、L124）的突变导致家族性渗出性玻璃体视网膜病变(FEVR)；而破坏FZD4结合（如K104、V45）的突变则引发Norrie病。这种"结合界面-疾病表型"的对应关系为遗传诊断提供了结构依据。

Norrin与RSPOs的信号分化机制
比较结构生物学分析表明，RSPOs通过招募ZNRF3/RNF43泛素连接酶增强Wnt信号，而Norrin-LGR4信号则不依赖该机制。竞争实验显示二者结合位点部分重叠，Norrin可剂量依赖地抑制RSPO4活性，但在共表达LRP6时又能协同增强信号最大值，揭示出动态平衡的调控模式。

治疗性纳米抗体的开发
通过骆驼免疫获得的纳米抗体NB18能以0.15nM亲和力结合LGR4，其冷冻电镜结构显示CDR3区与LGR4的D281/S300等残基形成2018?²的相互作用界面。功能实验证实NB18可同时阻断Norrin和RSPO2信号（IC₅₀分别为0.59nM和4.3nM），为干预Wnt相关疾病提供了新型工具分子。

这项研究从原子层面揭示了LGR4受体通过构象可塑性实现信号分化的新机制，解决了领域内关于LGR家族在视网膜血管发育中作用的长期争议。提出的"结合界面-疾病表型"关联模型为遗传性视网膜病变的精准诊断提供了理论基础，而开发的纳米抗体则为靶向Wnt通路的药物设计开辟了新途径。这些发现不仅深化了对细胞信号转导复杂性的认识，也为治疗癌症、视网膜血管疾病等重大疾病提供了新的干预策略。