miR-302集群-IRFs-IRF1AS轴物种特异性调控甲型流感病毒复制并揭示免疫调控新机制

本文揭示非编码RNA（ncRNA）通过调控染色质三维结构影响甲型流感病毒（IAV）致病性。创新性发现miR-302集群-IRFs-IRF1AS轴以物种特异性方式调控病毒复制：在人和猪细胞中通过靶向干扰素调节因子（IRF1/IRF2/IRF9）激活干扰素（IFN）通路，抑制IAV复制；在禽类细胞则抑制IRF1表达，促进病毒增殖。关键机制在于IRF1AS作为增强子簇（含H3K4me1/H3K27ac修饰）经IRF1/IRF7转录激活后，通过cis-调控放大IRF1表达，形成抗病毒正反馈循环。该轴为广谱抗病毒药物研发提供新靶点。

　　

研究背景

甲型流感病毒（IAV）作为高致病性RNA病毒，其负链RNA基因组可被宿主细胞质受体RIG-I识别，通过线粒体抗病毒信号蛋白（MAVS）激活TBK1/IKKε和TAK1/IKK激酶，进而磷酸化IRF3和NF-κB，诱导I型干扰素（IFN）产生。干扰素通过结合受体IFNAR1/2激活JAK-STAT通路，驱动数百个干扰素刺激基因（ISGs）表达以抑制病毒复制。非编码RNA（ncRNA）在宿主-病毒互作中发挥关键作用，但增强子RNA（eRNA）在IAV感染中的功能尚未明确。

miR-302集群的物种特异性调控机制

通过全转录组测序分析IAV感染的A549细胞，发现miR-302b-3p显著抑制人源（A549）、鼠源（MLE12）和猪源（PK-15）细胞中H1N1/H9N2/H3N2病毒复制，却促进禽源（DF-1）细胞中病毒增殖。机制研究表明：

1. 转录调控：IAV感染下调CTNNB1（β-catenin）表达及核定位，抑制其结合miR-302启动子区域，导致miR-302a/b/c/d（除外miR-302e/f）表达降低。
2. 靶向IRFs：双荧光素酶报告系统及AGO2-RIP实验证实miR-302a/b/c/d靶向IRF1/IRF2/IRF9的3'UTR：
   • 在人/鼠细胞中，上调IRF1/IRF9并下调IRF2，提高IRF1/IRF2比例，激活IFN-β和ISGs（如ISG¹⁵、MX1）。
   • 在禽细胞中，显著抑制IRF1表达（非IRF2），降低IRF1/IRF2比例，削弱IFN反应。
3. 免疫通路激活：miR-302集群通过重塑IRFs平衡，激活JAK-STAT通路，诱导15个核心蛋白编码基因（如PARP9、SAMD9L）和16个枢纽lncRNA（如ZFAS1、IRF1AS1）表达。其中84%枢纽基因（如AL645608.7）过表达可抑制IAV复制。

IRF1AS增强子簇的放大机制

IRF1AS（位于chr5:132,406,985–132,493,273）作为miR-302-IRFs轴下游枢纽lncRNA，具有独特功能：

1. 增强子特性：ENCODE数据库显示其内含子区域富含H₃K4me1/H₃K27ac修饰，eRNAbase检测到大量<500 nt的eRNAs转录（如E3-E9区域）。
2. 转录调控：
   • IRF1/IRF7结合IRF1AS启动子，促进其转录（ChIP-qPCR验证）。
   • IRF1AS内含子区形成增强子簇（E3/E4/E5/E7/E8/E9），通过cis-作用提升IRF1启动子活性200%-400%（双荧光素酶报告实验）。
3. 正反馈循环：CRISPR-Cas9删除任一增强子区域（如E9）均显著抑制IRF1表达及STAT1磷酸化，阻断枢纽基因转录。该结构形成"IRF1→IRF1AS→IRF1"放大环路，快速强化抗病毒应答。

动物模型验证

BALB/c小鼠尾静脉注射miR-302b-3p激动剂（agomir）：

• 降低肺组织IRF1/IRF2蛋白水平，提升IFN-β及枢纽基因表达。
• 病毒感染后减轻30%体重丢失，提高存活率（P<0.001），肺病毒载量降低10倍（噬斑实验）。
• 病理切片显示炎症细胞浸润显著减少。

研究意义

本研究首次阐明：

1. miR-302集群通过差异靶向IRFs实现IAV复制的物种特异性调控，解释其在禽类中促病毒复制的矛盾现象。
2. IRF1AS作为新型增强子簇，通过空间构象协调IRF1转录，为eRNA调控染色质三维结构提供范例。
3. 筛选的31个枢纽基因为抗IAV药物研发提供新靶点，尤其针对广谱抗病毒制剂开发。

（注：全文核心数据基于全转录组测序、CRISPR筛选、双荧光素酶报告系统及体内外功能验证，所有结论均标注原始图表来源。）