贝莱斯芽孢杆菌HX0039通过iturin A介导的拮抗机制防控桑黄绿霉病的研究

本研究揭示了贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）HX0039通过产生iturin A、fengycin等脂肽类物质，显著抑制桑黄绿霉病原菌（Trichoderma virens SH4）的生长，破坏其细胞膜完整性，田间防效达83.33%。基因组分析（anti-SMASH）显示其含15个次级代谢基因簇，UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS鉴定出关键抗菌物质。该菌株对哺乳动物安全（IC50=44.22 μg/mL），为替代化学杀菌剂提供了新策略。

　　

研究背景

桑黄（Sanghuangporus vaninii）作为兼具食用和药用价值的大型真菌，富含多糖、黄酮等活性成分，具有抗肿瘤、抗炎等功效。然而，木霉属（Trichoderma spp.）引起的绿霉病严重威胁其产量和品质。传统化学杀菌剂存在耐药性和环境风险，而贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）因其广谱抑菌能力成为生物防治的研究热点。

材料与方法

从安徽金寨桑黄栽培基地土壤中分离获得拮抗菌株HX0039，通过形态学观察、生理生化试验（Voges-Proskauer阳性）和分子鉴定（16S rRNA、gyrA、gyrB基因系统发育树）确认为贝莱斯芽孢杆菌。采用牛津纳米孔测序技术完成全基因组测序（4.07 Mb染色体+63.9 kb质粒），结合anti-SMASH预测次级代谢基因簇。通过超高效液相色谱-四极杆-静电场轨道阱质谱（UPLC-Q-Exactive-Orbitrap-MS）分析代谢产物。

体外实验采用平板对峙法（PDA培养基）评估对17种病原菌的抑制率，体内实验通过桑黄栽培袋接种评估防效（BE值计算）。通过PI染色观察细胞膜损伤，并检测粗提脂肽（CLPs）的最小抑菌浓度（MIC=227.3 μg/mL）。安全性测试包括溶血试验、大鼠小肠隐窝上皮细胞（IEC6）毒性及小鼠灌胃实验。

研究结果

1. 广谱抑菌活性：HX0039对T. virens SH4的抑制率达65.49%（细胞悬液）和82.08%（无细胞上清液），且对镰刀菌（Fusarium）、炭疽菌（Colletotrichum）等16种病原菌均表现显著抑制。
2. 田间防效突出：接种HX0039的桑黄栽培袋绿霉发病率降至16.67%（对照组100%），且不影响子实体形成。
3. 基因组特征：预测到15个次级代谢基因簇，包括fengycin、bacillomycin D、iturin、surfactin等脂肽合成基因（ituA/B/C、srfAA/AB/AC）。
4. 关键代谢物鉴定：CLPs中检出iturin A（m/z 1,043.55-1,093.56）、fengycin（m/z 1,463.81-1,491.84）、macrolactin A（m/z 367.23）等。共培养实验显示SH4诱导HX0039特异性增产iturin A同系物（C₁₄-C₁₆）。
5. 作用机制：PI染色证实HX0039破坏T. virens SH4细胞膜完整性，导致内容物泄漏。
6. 生物安全性：无溶血现象，小鼠器官指数（心、肝、脾、肺、肾）与对照组无显著差异（P>0.05）。

讨论与创新点

本研究首次揭示贝莱斯芽孢杆菌HX0039通过iturin A介导的膜损伤机制防控桑黄绿霉病。相较于已报道的枯草芽孢杆菌（B. subtilis）B-38和贝莱斯芽孢杆菌QST713，HX0039具有更广谱的抑菌活性（覆盖17种病原菌）和更高的热稳定性（100℃处理30分钟仍保持活性）。其基因组中预测的difficidin和bacillaene合成基因可能协同增强抗菌效果。

局限性在于iturin A的具体作用通路（如氧化应激或糖代谢干扰）需进一步验证。未来研究可聚焦于iturin A的分子靶点解析及田间规模化应用方案优化。

应用前景

该菌株为开发桑黄绿色栽培技术提供了可靠候选菌剂，其脂肽类代谢物亦可作为新型生物农药先导化合物。研究策略（基因组-代谢组联合分析）为微生物拮抗机制研究提供了范式。