光合细菌Rhodopseudomonas palustris CGA009中木质素降解酶的高度混杂性机制及其生物炼制应用

（编辑推荐）本研究通过多组学方法首次揭示了光合细菌Rhodopseudomonas palustris CGA009利用高度混杂性酶系降解H/G/S型木质素的分子机制，提出"超通路"代谢模型并验证氧化还原稳态（redox homeostasis）是限速步骤。创新性应用CRISPRi技术证明NAD+再生基因（如rpa3717）的敲除导致生长抑制达71%，为木质素生物炼制（lignin valorization）提供了关键理论支撑。

　　

木质素降解的代谢迷宫与光合细菌的破解之道

ABSTRACT
木质素作为农业废弃物的"顽固分子"，占植物生物量的30%却长期被焚烧处理。革兰阴性光合细菌Rhodopseudomonas palustris CGA009展现出惊人的代谢可塑性——既能降解所有类型木质素（H/G/S型），又能生产聚羟基丁酸酯（PHB）、氢气等高值化学品。这项研究通过开创性的多组学联用策略，首次在该菌中应用CRISPRi技术，揭示了木质素降解的"超通路"机制，并证明细胞氧化还原平衡比酶丰度更能决定降解效率。

INTRODUCTION
木质素复杂的苯丙烷结构使其成为自然界最难降解的聚合物之一。传统纸浆工业每年产生1.18亿吨木质素废弃物，主要处理方式是直接焚烧。虽然已有研究证明其可转化为碳纳米管、苯系物等产品，但经济可行性始终是瓶颈。R. palustris的特殊之处在于其四种代谢模式（光异养/光自养/化能异养/化能自养）和固碳固氮能力，此前仅知其可通过苯甲酰辅酶A途径（BAD pathway）降解H型木质素，但对G/S型木质素的代谢机制仍是谜题。

RESULTS AND DISCUSSION

R. palustris生长特性
在1mM木质素单体喂养实验中，p-香豆酸（p-coumarate）能被直接利用，而芥子醇（sinapyl alcohol）则表现出典型的二次生长曲线（diauxic growth）。厌氧条件下菌体密度（OD₆₆₀ 3.19）显著高于好氧条件，暗示某些关键酶可能氧敏感。

组学数据揭示酶混杂性
转录组-蛋白质组联合分析发现：p-香豆酸途径基因在各类木质素条件下均显著上调（log₂FC>2）。Pearson相关性热图显示厌氧样本间代谢通路相似性更高（r=0.46），提示相同酶系可能处理不同木质素类型。机器学习工具EnzRank预测酒精脱氢酶rpa1205和醛脱氢酶rpa1206是启动降解的关键"万能钥匙"，前者能将三种木质素单体统一转化为醛类中间体。

超通路构建
代谢重构显示：

1. 脱乙酰化环节：rpa1786催化去除乙酰辅酶A基团
2. 去甲基化奇迹：通常需氧的vanAB酶系（rpa3619-rpa3621）在厌氧条件下仍保持活性，将芥子酸酯（syringate）转化为没食子酸（gallate）
3. 芳香环裂解分歧：好氧时依赖4,5-间位裂解（pmd operon），厌氧时可能通过BAD途径与新型未知途径并行

代谢瓶颈的颠覆性发现
通过ME模型预测和CRISPRi验证，敲低NAD⁺再生基因rpa3717使生长抑制达71%，而敲除代谢酶rpa1786仅产生轻微影响。这证实木质素降解的"阿喀琉斯之踵"在于电子传递而非酶量——每个芳香环降解需消耗11个NAD⁺，菌体不得不将38%的蛋白组用于维持氧化还原平衡。

MATERIALS AND METHODS
研究建立了首个R. palustris CRISPRi系统：使用带有dCas9基因的质粒（Addgene ID见附表），通过IPTG诱导实现基因敲低（最高达5.58倍）。代谢物检测采用LC-MS/MS多反应监测模式（MRM），靶向分析12种芳香族中间体。

CONCLUSIONS
这项工作不仅绘制出R. palustris降解木质素的完整路线图，更指明未来改造方向：强化NAD⁺再生系统比过表达降解酶更有效。发现的厌氧去甲基化现象挑战了传统酶学认知，为开发新型木质素生物炼制工艺奠定基础。